[发明专利]一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法。

背景技术

癌症是人类健康的三大杀手之一，每年因恶性肿瘤导致死亡的人数有逐年增加的趋势。现有的肿瘤疾病的治疗中，通常有化疗、放疗和手术治疗几种方式。由于肿瘤手术有其局限性，化学疗法多与手术、放疗等联合使用，增强对肿瘤细胞的杀伤作用。使用单一药物化疗通常都不能取得理想的治疗效果，因此肿瘤的治疗通常采用多种化疗药物联合应用。然而，多药联合治疗时，多药耐药是对化疗药物疗效及病人康复的一大障碍。为了研究不同癌症多药耐药的机制，就必须建立多药耐药的模型。由此，建立一种多药耐药的细胞模型或动物模型显得异常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，旨在解决肿瘤细胞多药耐药问题。

本发明是这样实现的，一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

提供肿瘤细胞，并进行培养；

使用盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞进行药物诱导，得到盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系；

使用RNAi沉默所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的PARP1基因。

本发明提供的一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，利用盐酸米托蒽醌诱导癌细胞形成盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系，并在所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的基础上采用RNAi技术沉默多药耐药的关键基因PARP1，建立了多药耐药肿瘤细胞模型，从而抑制PARP1对DNA的修复，提高肿瘤细胞对药物和放化疗的敏感性。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种多药耐药肿瘤细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

S01.提供肿瘤细胞，并进行培养；

S02.使用盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞进行药物诱导，得到盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系；

S03.使用RNAi沉默所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系的PARP1基因。

具体的，上述步骤S01中，所述肿瘤细胞的选用不受限制，任何肿瘤细胞均可以用于本发明实施例中用作构建多药耐药肿瘤细胞模型。优选的，本发明实施例可采用MCF7细胞(人乳腺癌细胞)来构建多药耐药肿瘤细胞模型。

上述步骤S02中，使用盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞进行药物诱导，可以得到盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系。为了获得效果诱导效果较好的盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系，作为优选实施例，使用终浓度为0.005-0.04μM的所述盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞进行染毒，诱导耐药。进一步的，优选使用终浓度为0.02μM的所述盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞进行染毒，诱导耐药。

为了比较药物诱导的效果，可选用不同浓度的盐酸米托蒽醌平行对照组对所述肿瘤细胞进行药物诱导，同时设立野生型空白对照组。作为具体实施例，将盐酸米托蒽醌粉末配置成5μmol/L的母液，进行稀释处理分别得到终浓度为0.005μM、0.01μM、0.02μM、0.04μM的盐酸米托蒽醌平行组。各平行组分别选用5μL、10μL、20μL、40μL体积的米托蒽醌依次对所述肿瘤细胞如MCF-7细胞进行染毒，诱导耐药。24h换液一次，并继续染毒；传代时停药，贴壁后再染毒。持续染毒30天后，对每个完成诱导阶段的细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，拍照，并于液氮中冻存保种备用。

本发明实施例中，为了检测所述盐酸米托蒽醌对所述肿瘤细胞的药物诱导效果，可对获得的肿瘤细胞进行耐药性检查。作为具体实施例，采用流式细胞术检测经所述盐酸米托蒽醌诱导后的肿瘤细胞的耐药性，具体操作如下：

Q01.将所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系停药培养两周后，将所述野生型空白对照组及各所述盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系分别接种到六孔板上；

Q02.待细胞融合到70-80％时，加入终浓度为3μM的带荧光的米托蒽醌，放入培养箱中培养1-4h，更优选为2h，为了防止所述米托蒽醌所带的荧光淬灭，进行避光处理；

Q03.使用PBS洗涤上述培养的细胞后，换液，继续培养1h，避光处理；

Q04.采用胰酶消化处理后收集细胞，PBS悬浮，吹打成单个细胞，避光；

Q05.上机，检测。

作为本发明另一个具体实施例，可以采用Western blotting检测盐酸米托蒽醌诱导耐药细胞系，具体操作可参照如下：