[发明专利]一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法

权利要求书

1.一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法，其特征在于：依次包括以下步骤：

a）人胰腺癌细胞培养：将人胰腺癌细胞培养于RPMI-1640培养基中，RPMI-1640培养基中含胎牛血清、生物活性为100 IU/mL的青霉素和生物活性为100 μg/mL的链霉素，RPMI-1640培养基培养于37°C， CO₂体积浓度为5%培养箱中；

b）单层细胞迁移分析：将人胰腺癌细胞接种于6孔板中培养24h，当人胰腺癌细胞汇合度达90%以上时，用200μl无菌Tip枪头固定一个角度进行划痕，然后使用无菌PBS洗去人胰腺癌细胞碎片，再加入新鲜的RPMI-1640培养基，其中一组不加入苦参碱作为空白组，药物处理组分别加入浓度为25μg/ml、50μg/ml苦参碱作用24-48h，最后通过倒置相差显微镜跟踪拍摄细胞迁移能力；

c）细胞浸润分析：将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4×10⁴密度接种于细胞浸润小室，细胞浸润小室上部为含有2% FBS的的RPMI-1640完全培养基，细胞浸润小室下部为含有10% FBS的RPMI-1640完全培养基，人胰腺癌细胞在培养箱中孵育2h后，分别加入浓度为0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的苦参碱处理并在培养箱中孵育10h，然后加入多聚甲醛室温固定15min，使用无菌PBS洗三次后加入0.2%结晶紫染10min，去离子水冲洗干净后置于倒置显微镜下拍照计数，实验重复三次进行统计分析；

d）酶联免疫吸附分析：将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4×10⁴密度接种于6孔板培养过夜后，分别加入浓度为0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的苦参碱处理并在培养箱中孵育24h，将人胰腺癌细胞进行裂解处理，收集人胰腺癌细胞上清液，分别采用MMP-9 ELISA试剂盒、MMP-2 ELISA试剂盒来检测不同实验组中MMP-9和MMP-2的浓度；

e）免疫印迹分析：收集人胰腺癌细胞加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂Cocktail，在冰浴中裂解30min，离心机离心30min后收集上清，通过BCA法测蛋白浓度并均衡各组蛋白，同等量细胞总蛋白用于12% SDS-PAGE电泳，蛋白经湿转法转到PVDF膜，室温下添加5%脱脂奶粉后封闭1h，然后加入兔抗人wnt、β-catenin、MT1-MMP，在4℃的温度下孵育过夜，采用PBST缓冲液洗三次，加入HRP标记的山羊抗兔二抗，室温孵育1h，PBST缓冲液洗三次后，加入ECL超敏发光液，将PVDF膜进行压片、曝光、显影及定影，图像经Image J软件灰度扫描后进行统计分析。