[发明专利]一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法的技术领域。

背景技术

苦参碱是一种从苦参等豆科植物中提取出来的生物碱，被广泛应用于抗菌、抗病毒治疗中。近几年的研究发现，苦参碱能显著抑制肿瘤细胞增殖。临床工作中苦参碱已经用于宫颈癌及白血病的治疗。深入探讨苦参碱药理及生物学机制对于开发苦参碱临床应用具有重要意义。Wnt信号通路不仅在机体正常发育中具有重要作用，而且在肿瘤发生发展中也具有重要作用。研究发现在多种肿瘤的发生及进展中均存在Wnt通路的异常活化。 现在研究认为Wnt/PCP通路与一些细胞极化、 迁移及转移相关的分子结合，在调节细胞迁移及浸润中发挥重要作用。 β-catenin是Wnt信号通路中重要的调节介质，Wnt通路活化后，β-catenin进入细胞核内调节Wnt靶基因的转录。在细胞核内β-catenin与Tcf-4形成复合体，调节MT1-MMP的转录,进而调节细胞迁移与浸润。在前期研究中，我们发现苦参碱能抑制肿瘤细胞迁移、浸润及转移。但具体机制不明。苦参碱抑制肿瘤细胞迁移是否与调节Wnt通路活性有关，值得进一步深入探讨。

发明内容

本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法，采用该方法分析后能得知苦参碱作用一定时间能显著降低人胰腺癌细胞的迁移与浸润能力，人胰腺癌细胞迁移相关蛋白MT1-MMP及Wnt 、β-Catenin表达明显降低；进一步检测发现MT1-MMP转录活性也显著降低，与Wnt信号通路活性一致，苦参碱通过调节Wnt通路活性，降低MT1-MMP的转录与表达，进而抑制人胰腺癌细胞的迁移与浸润。

为实现上述目的，本发明提出了一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法，其特征在于：依次包括以下步骤：

a）人胰腺癌细胞培养：将人胰腺癌细胞培养于RPMI-1640培养基中，RPMI-1640培养基中含胎牛血清、生物活性为100 IU/mL的青霉素和生物活性为100 μg/mL的链霉素，RPMI-1640培养基培养于37°C， CO₂体积浓度为5%培养箱中；

b）单层细胞迁移分析：将人胰腺癌细胞接种于6孔板中培养24h，当人胰腺癌细胞汇合度达90%以上时，用200μl无菌Tip枪头固定一个角度进行划痕，然后使用无菌PBS洗去人胰腺癌细胞碎片，再加入新鲜的RPMI-1640培养基，其中一组不加入苦参碱作为空白组，药物处理组分别加入浓度为25μg/ml、50μg/ml苦参碱作用24-48h，最后通过倒置相差显微镜跟踪拍摄细胞迁移能力；

c）细胞浸润分析：将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4×10⁴密度接种于细胞浸润小室，细胞浸润小室上部为含有2% FBS的的RPMI-1640完全培养基，细胞浸润小室下部为含有10% FBS的RPMI-1640完全培养基，人胰腺癌细胞在培养箱中孵育2h后，分别加入浓度为0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的苦参碱处理并在培养箱中孵育10h，然后加入多聚甲醛室温固定15min，使用无菌PBS洗三次后加入0.2%结晶紫染10min，去离子水冲洗干净后置于倒置显微镜下拍照计数，实验重复三次进行统计分析；

d）酶联免疫吸附分析：将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4×10⁴密度接种于6孔板培养过夜后，分别加入浓度为0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的苦参碱处理并在培养箱中孵育24h，将人胰腺癌细胞进行裂解处理，收集人胰腺癌细胞上清液，分别采用MMP-9 ELISA试剂盒、MMP-2 ELISA试剂盒来检测不同实验组中MMP-9和MMP-2的浓度；