[发明专利]一种测定Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的方法

权利要求书

1.一种测定Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的方法，其特征在于，所述的Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的研究方法通过收集经全髋置换术取下的SANFH的股骨头标本作为实验组，股骨颈骨折髋关节置换术后标本作为对照组，切取股骨头标本经固定、脱钙，制作切片，电镜观察骨细胞形态变化，光镜观察其病理变化，并用HE染色计数空缺骨陷窝，免疫组织化学染色法检测Dickkopf-1的表达，用TUNEL凋亡检测试剂盒检测骨细胞凋亡，探索Dickkopf-1与细胞凋亡在SANFH中的作用；

测定Dickkopf-1与细胞凋亡在激素性股骨头缺血性坏死中作用的方法的具体步骤如下：

步骤一、收集全髋置换手术后取下的股骨头，-80℃冰箱保存，SANFH例作为实验组，新鲜股骨颈骨折标本作为对照组，对照组患者排除心血管及免疫系统疾患，无烟酒嗜好及服用激素史；

步骤二、标本制作：

将取下的股骨头自冠状面对半剖开，切取股骨头软骨骨块，用4％多聚甲醛固定12小时后，13％乙二胺四乙酸脱钙，脱钙完全后，常规石蜡包埋；

步骤三、光镜下组织形态学观察；

取石蜡包埋组织块，制成厚5μm切片，HE染色，将染色后的切片分别置于100倍及400倍光镜下观察组织病理学改变，用空缺骨陷窝率来表示骨细胞坏死的病理变化；

步骤四、透射电子显微镜观察：

在股骨头坏死区切取骨块，2.5％戊二醛液前固定，10％EDTA脱钙，1％饿酸后固定，环氧树脂包埋，采用瑞典LKB2800型切片机制作超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铝染色，电镜观察；

步骤五、TUNEL法检测骨细胞凋亡情况；

步骤六、免疫组织化学法检测Dickkopf-1；

步骤七、统计学处理；

HE染色的具体方法为：

第一步、60℃烤箱脱蜡30分钟；

第二步、二甲苯I脱蜡10分钟；

第三步、二甲苯II脱蜡5分钟；

第四步、无水乙醇洗去二甲苯2次，每次1分钟；

第五步、95％乙醇2次，每次1分钟；

第六步、90％乙醇1分钟；

第七步、85％乙醇1分钟；

第八步、自来水洗去乙醇5分钟；

第九步、苏木素着色4分钟；

第十步、自来水冲1分钟；

第十一步、1％盐酸酒精分化20秒；

第十二步、自来水洗1分钟；

第十三步、1％稀氨水返蓝30秒，蒸馏水洗1分钟；

第十四步、伊红染色20秒，0、85％酒精脱水20秒；

第十五步、90％酒精脱水30秒；

第十六部、95％酒精脱水1分钟；

第十七步、95％酒精脱水1分钟；

第十八步、无水乙醇I脱水2分钟；

第十九步、无水乙醇II脱水2分钟；

第二十步、二甲苯I2分钟；

第二十一步、二甲苯II2分钟；

第二十二步、二甲苯III2分钟；

第二十三步、中性树胶封片；

TUNEL法检测骨细胞凋亡情况的具体方法为：

第一步、标本的处理：玻片预先用APES进行处理；细胞涂片和冰冻切片：必须马上固定，用4％的多聚甲醛PH为7.0-7.6，在室温固定35分钟，0.01MPBS液洗2次，每次2分钟，蒸馏水洗涤2次每次2分钟；组织：立刻固定，10％中性缓冲甲醛液固定5小时，石蜡包埋，切片脱蜡干净后入水；

第二步、制备新鲜的3％的H₂O₂，在室温下处理10分钟，蒸馏水洗涤3次，每次2分钟；

第三步、标本片加0.01MTBS1∶200的新鲜稀释ProteinaseK37℃消化15分钟，0.01M的TBS液洗3次，每次2分钟；

第四步、每张标本片加标记缓冲液20μl，以防止切片干燥，将TdT和DIG-d-UTP各1μl与18μl标记缓冲液混和滴于 切片上，甩掉其上多余的液体再滴标记液，每片20μl，将样品放在37℃湿盒里2小时；

第五步、0.01M的TBS液洗涤3次，每次2分钟；

第六步、每片滴封闭液50μl，室温下30分钟后，甩去封闭液；

第七步、将1∶100的抗体稀释液稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀，每片标本滴50μl，放在37℃湿盒里反应30分钟，用0.01MTBS洗涤3次，每次2分钟；

第八步、用抗体稀释液1∶100稀释SABC：将SABC10μl加入1ml的抗体稀释液，混匀，每片滴50μl，37℃反应30分钟，0.01MTBS洗涤4次每次5分钟；

第九步、DAB显色：在DAB试剂盒的A、B、C试剂中各加入一滴蒸馏水，混匀，滴到标本片上，显色20分钟，显微镜下观察着色情况后水洗；

第十步、苏木素轻度复染；0.01MTBS洗，蒸馏水洗；脱水，透明，封片；光学显微镜下观察且记录实验数据；TUNEL染色，当细胞核中出现棕黄色颗粒的为阳性细胞，即为凋亡的细胞；在光镜下，随机在每张玻片上找5个高倍视野，每个高倍视野下计数50个骨细胞，计算凋亡细胞指数等于每个视野内凋亡细胞数除以每个视野内细胞总数。