[发明专利]一种伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物及其检测方法和检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物及其检测方法和检测试剂盒。

背景技术：

沃尔巴克氏体(Wolbachia)是广泛分布于节肢动物体内的共生微生物，它可能是昆虫共生微生物中最为丰富的类群。它分布于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目等昆虫种类中。它以垂直传播作为其在宿主世代间传递的基本模式。它稳定地存在于宿主的生殖细胞内，通过卵细胞传递给宿主子代，并可通过多种方式如细胞质不亲和、雌性化和杀雄性等调控宿主的生殖活动。通过这些调控作用促进其在宿主种群内广泛传播。

在沃尔巴克氏体(Wolbachia)引起的宿主生殖行为改变中，细胞质不亲和(Cytoplasmic Incompatibility，CI)是最常见的一种类型。它表现为当被沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染的雄蚊与未感染雌蚊或感染不同种类Wolbachia的雌雄蚊交配时，精子和卵子结合后胚胎无法发育。沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胞质不亲和的特性可导致Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同种Wolbachia的蚊群进行种群压制和种群替代。它的应用对蚊媒病防治具有巨大的价值。近期研究发现，沃尔巴克氏体(Wolbachia)不仅具有上述的特性外，同时它还能在蚊子体内与蚊子携带的一些重要的病原生物(如登革病毒，疟原虫等)相互作用，抑制它们在蚊子体内的增值和扩散从而在阻断这些病原生物传播于人类。沃尔巴克氏体(Wolbachia)的这种抑制作用与它在蚊子体内组织的分布相关，所以，了解沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊子体内组织分布有助于快速筛选出传播阻断效果最好的沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染的蚊子，也有助于监测沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊群中的垂直传播，同时也有利于高效率地监测大规模大地域范围的沃尔巴克氏体(Wolbachia)在蚊子组织中的感染情况。

在自然界中，蚊子的种类有很多，常见的有伊蚊和库蚊两种。伊蚊分为白纹伊蚊和埃及伊蚊，其中埃及伊蚊不携带沃尔巴克氏体。由于沃尔巴克氏菌只能存活于宿主体内，不能在体外自由生活，因而如何有效特异地检测沃尔巴克氏菌是对该细菌研究的必备工具。比较常用的检测手段有聚合酶链反应法(PCR法)和免疫染色法。免疫染色法耗时耗力，而且特异性不好。随着PCR方法的普及，针对沃尔巴克氏体的检测有了很大的进步。不同蚊种携带不同的沃尔巴克氏体，通过PCR结果能够直观的看出蚊子携带的不同沃尔巴克氏体类型，这样为我们的日常检测提供了很大的便利。目前针对不同沃尔巴克氏体PCR检测的方法还不完善。

发明内容：

本发明的目的是提供一种专一性强、特异性高和灵敏度高的伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物。

本发明的伊蚊A型和库蚊沃尔巴克氏体的荧光检测引物，其特征在于，包括

(1)针对伊蚊A型沃尔巴克氏体：

wAlbAF：5’-GACATCAGGGTTGATGTTGA-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；

wAlbAR：5’-GGAGTGATAGGCATATCTTCAAT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；

探针A：5’-ATTTACCCCAGCAGATACTATTGCG-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；

探针A的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1；

(2)针对库蚊沃尔巴克氏体：

wPipF：5’-GCAGGGCTATATTTTGGG-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；

wPipR：5’-ATCAGTTTCTAGGTCATT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)；

探针B：5’-TCATCTATTAATAAAATAGGAGTATTACTAT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；

探针B的两端分别结合有荧光发生基团HEX和荧光淬灭基团BHQ1。