[发明专利]一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA及其应用。

背景技术

ESCCAL_1是曹巍等从人食管鳞状细胞癌组织中筛选出的一个食管鳞状细胞癌特异相关长片段非编码RNA转录物，它在食管鳞状细胞癌组织中高表达，相应正常组织中低表达【Cao W,Wu W,Shi F,Chen X,Wu L,Yang K,Tian F,Zhu M,Chen G,Wang W et al:Integrated analysis of long noncoding RNA and coding RNA expression in esophageal squamous cell carcinoma.International journal of genomics 2013,2013:480534.】；并且促进食管鳞状细胞的侵润和转移、抑制细胞的凋亡。长片段非编码RNA(long noncoding RNA，LncRNAs)通常是指长度在200个核苷酸到数千个核苷酸的非蛋白质编码RNA，LncRNAs在基因组转录过程中异常丰富，具有时空表达特异性，缺乏有义开放阅读框(open reading frames,ORF)。它们具有转录调控、转录后调控、蛋白质翻译调控等多种作用。越来越多的证据表明：LncRNAs参与许多细胞的生长过程，包括胚胎干细胞多能性、细胞周期调控、疾病发生，以及肿瘤的形成等【Guttman M,Rinn JL:Modular regulatory principles of large non-coding RNAs.Nature 2012,482(7385):339-346.】。

ESCCAL_1作为长链非编码RNA的一个新的成员，其在肿瘤发生发展中的作用还没有深入的研究。申请人的研究发现ESCCAL_1在肿瘤细胞、特别是在食管鳞状细胞癌中含量明显高于正常细胞，且ESCCAL_1本身能够明显促进肿瘤细胞的生长和迁移。而目前对于其促进机理及如何抑制ESCCAL_1促进肿瘤细胞的生长和迁移的过程还没有研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA及其应用，能够很好的对肿瘤起到抑制作用，为其在抗肿瘤药物中的应用提供了基础。

本发明的技术方案如下：

一种用于特异抑制ESCCAL_1表达干涉RNA，所述的干涉RNA序列SEQ ID NO.5所示。

一种利用以上所述的干涉RNA制备干涉细胞株的方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的干涉RNA合成双链DNA；

(2)通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的RNAi慢病毒载体GV112和步骤(1)合成的双链DNA进行连接转化，制备感受态细胞；

(3)制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，培养后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液；

(4)将慢病毒颗粒感染EC9706细胞，筛选出ESSCAL_1稳定干涉的细胞株。

以上所述的制备干涉细胞株的方法，步骤(1)中合成双链DNA的方法为将干涉RNA溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15分钟，然后自然冷却至室温，TTTTTG是终止信号。

以上所述的制备干涉细胞株的方法，步骤(2)中连接反应体系为：1μL线性化的载体DNA 100ng/μL、1μL DNA oligo 100ng/μL、2μL 10XT4噬菌体DNA连接酶缓冲液、1μL T4噬菌体连接酶，反应体系为20μL。

以上所述的制备干涉细胞株的方法，步骤(3)中共转染后8h更换为完全培养基，培养48h。

以上所述的干涉RNA在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明首次提供了一种用于特异抑制ESCCAL_1表达的干涉RNA，并将其制备得到干涉细胞株，将干涉细胞株进行动物实验，并与对照组进行对比，结果表明其能够明显抑制ESCCAL_1表达，进而抑制了肿瘤的生长与迁移，对于开发抗肿瘤药物有着重要的参考价值。

附图说明

图1为实施例2中敲除ESCCAL_1对肿瘤细胞侵袭的影响图；其中CON:正常目的细胞、未感染任何病毒的细胞组；NC:正常目的细胞、加阴性对照病毒感染的细胞组；KD:正常目的细胞、加目的基因敲减病毒感染的细胞组；