[发明专利]利用蛇足石杉细胞和内生真菌共培养富集石杉碱甲的方法

权利要求书

1.利用蛇足石杉细胞和内生菌共培养富集石杉碱甲的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)生产石杉碱甲的蛇足石杉人工驯化培养；

(2)蛇足石杉单细胞获取；

(3)蛇足石杉-内生菌共培养体系的建立；

(4)活细胞的观察计数；

(5)石杉碱甲及麦角甾醇的提取；

(6)石杉碱甲及麦角甾醇的检测；

(7)分析石杉碱甲含量随培养时间的变化趋势，得出最佳收获时间以富集石杉碱甲或者进行继代培养。

2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：用植物细胞活体染色剂对共培养体系中蛇足石杉悬浮细胞染色并计数。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用石杉碱甲和麦角甾醇来衡量共培养体系中植物细胞和内生菌的生长情况。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)生产石杉碱甲的蛇足石杉人工驯化培养是指：模拟蛇足石杉自然生存环境。人工驯化培养条件如下：

(1)用于栽培蛇足石杉的土壤组成为沙土∶河沙＝2∶1，土壤pH约为7。

(2)保持蛇足石杉的生存环境湿度在95％以上。

(3)保持蛇足石杉的生存环境光照在100Lx左右。

(4)首次将苔藓用于驯化培养中，将苔藓铺于土壤表面，优势在于苔藓起到保湿作用，维持了一个良好的生态环境。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)蛇足石杉单细胞获取是指：对蛇足石杉叶片进行表面消毒，以除去叶片表面的真菌及细菌，用机械破碎法获取叶肉细胞，按如下步骤进行：

(1)蛇足石杉叶片进行表面消毒，取蛇足石杉叶片，依次用以下方法除去叶片表面的真菌及细菌：70％酒精50s，0.5mg/L孔雀石绿8min，3％双氧水10min，无菌水3次。

(2)借助于透明胶带剥离叶片表面蜡质，将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上，用小刀刮去叶片表面蜡质，并用胶带反复粘贴2～3次以剥离蜡质。

(3)机械破碎法获取植物叶肉单细胞，将已剥离蜡质的叶片划成极小的小块，刮下置于碾钵中，加入5～10mL液体培养基，碾磨1～3min后，将混合悬液通过双层200目尼龙网过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心2min，取沉淀用培养液再悬浮。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)蛇足石杉-内生真菌共培养体系的建立是指：蛇足石杉单细胞悬浮液置于24℃恒温培养箱暗培养，约10天左右更换一次液体培养基，所用液体培养基主要成分包括MS基本培养基，5.0mg/L2，4-D，1.0mg/LKT，20.0g/L蔗糖，调节pH为5.8。

7.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤(4)活细胞的观察计数是指：将蛇足石杉悬浮细胞与中性红染液按4∶1的比例混合染色，静置15～20min后观察计数。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(5)石杉碱甲及麦角甾醇的提取按如下步骤进行：

(1)取样：取培养液5.0mL，置于冰箱冷冻室，反复冷冻解冻三次；

(2)将培养液及细胞解冻后，旋转蒸发除去水分，用10mL甲醇溶解，在30℃下超声处理2次，每次20min，其间间隔10min，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入10mL甲醇，按上述方法再次提取，滤过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇。

(3)用色谱甲醇充分溶解旋蒸得到的浸膏，转移至西林瓶，甲醇挥发，得到浸膏。

(4)甲醇挥发后得到的浸膏用1mL色谱甲醇充分溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤。