[发明专利]利用蛇足石杉细胞和内生真菌共培养富集石杉碱甲的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种植物细胞培养生产石松生物碱技术，具体地说是以植物细胞培养技术为手段，利用蛇足石杉细胞和内生菌共培养富集石松生物碱石杉碱甲，并以高效液相色谱仪为检测工具，对石杉碱甲和麦角甾醇进行检测，以确定石杉碱甲的最佳收获时间及继代培养时间点。

背景技术：

石杉碱甲(huperzine A)是石杉科石杉属植物蛇足石杉中提取出的一种生物碱，具有高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制活性，可用于治疗重症肌无力、提高青少年学习能力以及改善老年人记忆功能等，有着极大的市场需求。但蛇足石杉野生资源有限，且石杉碱甲在全草中含量甚微，长期采挖野生蛇足石杉必将导致资源的枯竭，另外，石杉碱甲合成成本较为高昂，难以实现产业化。长期以来蛇足石杉和内生真菌共存，基于生物模拟效应，内生真菌往往能产生与宿主相同或相似的生物活性成分，而麦角甾醇(ergosterol)又可以作为真菌生物量的衡量标准。

利用植物细胞培养技术生产石杉碱甲因其具有环境友好、生产周期短、可控性强等优点而日益受到人们的重视。

本发明避开了当前愈伤组织诱导法获取蛇足石杉单细胞中极难完全去除内生真菌的难点，通过蛇足石杉细胞和内生真菌共培养来富集石杉碱甲，再利用高效液相色谱检测培养液中蛇足石杉和麦角甾醇的含量，通过二者的含量变化确定细胞继代培养及石杉碱甲收获的最佳时间。

发明内容：

本发明的目的是提供一种通过蛇足石杉细胞和内生真菌的共培养体系来富集石杉碱甲的方法，细胞的收获时间由石杉碱甲和麦角甾醇的相对含量决定。这对蛇足石杉自然资源的保护和石杉碱甲的开发利用及实现工业化生产有十分重要的理论意义和实用价值。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

(1)生产有效生物碱的蛇足石杉人工驯化培养：用于栽培蛇足石杉的土壤组成为兰花土∶河沙＝2∶1，土壤pH约为7；保持蛇足石杉的生存环境湿度在95％以上；保持蛇足石杉的生存环境光照在100Lx左右；首次将苔藓用于驯化培养中，将苔藓铺于土壤表面，优势在于苔藓起到保湿作用，且维持了一个良好的生态环境。

(2)蛇足石杉单细胞获取：取蛇足石杉叶片，依次用以下方法进行表面消毒：70％酒精50s，0.5mg/L孔雀石绿8min，3％双氧水10min，无菌水3次；借助于透明胶带剥离叶片表面蜡质，将叶片贴于经紫外灭菌的胶布上，用小刀刮去叶片表面蜡质，并用胶带反复粘贴2～3次以剥离蜡质；机械破碎法获取植物叶肉单细胞，将已剥离蜡质的叶片划成极小的小块，刮下置于碾钵中，加入5～10mL液体培养基，碾磨1～3min后，将混合悬液通过双层200目尼龙网过滤，并用少量培养液淋洗滤布，将滤液在2000rpm的转速下离心2min，取沉淀用培养液再悬浮。

(3)蛇足石杉-内生真菌共培养体系的建立：蛇足石杉单细胞悬浮液置于24℃恒温培养箱暗培养，约10天左右更换一次液体培养基，所用液体培养基主要成分包括MS基本培养基，5.0mg/L2，4-D，1.0mg/LKT，20.0g/L蔗糖，调节pH为5.8。

(4)活细胞的观察计数：将蛇足石杉悬浮细胞与中性红染液按4∶1的比例混合染色，静置15～20min后观察计数。

(5)石杉碱甲及麦角甾醇的提取：取培养液5.0mL，置于冰箱冷冻室，反复冷冻解冻三次；将培养液及细胞解冻后，旋转蒸发除去水分，用10mL甲醇溶解，在30℃下超声处理2次，每次20min，其间间隔10min，滤过，得到滤液置于锥形瓶中，滤纸剪碎后加入10mL甲醇，按上述方法再次提取，滤过，合并两次滤液，旋转蒸发除去甲醇；用色谱甲醇充分溶解旋蒸得到的浸膏，转移至西林瓶，甲醇挥发，得到浸膏；甲醇挥发后得到的浸膏用1mL色谱甲醇充分溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤。

(6)石杉碱甲及麦角甾醇的检测：采用的反相色谱柱为Agilent TC C₁₈柱，由美国Agilent公司生产，规格4.6×150mm，填料粒度5μm，检测石杉碱甲的流动相为甲醇：0.08mol/L醋酸铵(25∶75，v/v)，波长为310nm，检测麦角甾醇的流动相为甲醇∶水(95∶5，v/v)，波长为282nm，两者所用流速均为1.000mL/min，温度均为25℃。其中石杉碱甲的保留时间为9.191min，麦角甾醇的保留时间为10.716min。

(7)分析石杉碱甲含量随培养时间的变化趋势：利用高效液相色谱快速地检测培养体系中石杉碱甲和麦角甾醇的含量，得出最佳收获及继代培养时间，以富集石杉碱甲。

本发明具有如下优点：