[发明专利]一种检测17β-雌二醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于材料检测领域，尤其涉及一种17β-雌二醇，特别是一种检测17β-雌二醇的方法。

背景技术

环境内分泌干扰物是指一种外源性物质，这类物质会导致未受损伤的有机体发生逆向健康影响，扰乱内分泌系统,甚至对有机体后代的繁殖系统、身体的生长和发育系统造成巨大的危害。17β-雌二醇，是一种活性最强的内分泌干扰物，长期接触17β-雌二醇将会对人体健康产生潜在而不可估量的危害。因此，我们迫切需要开发一种简单、灵敏、快速的检测体系实现对17β-雌二醇的实时检测。

然而，就目前来说，传统的方法，比如高效液相色谱法，液质联用，气质联用等方法虽早已成熟并准确可靠，但在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。一些新型的检测方法，比如电化学法，需要对电极进行修饰，识别能力有所欠缺；而酶联免疫法则易出现一些假阳性的结果，不能满足实验的稳定性。因此，建立高灵敏度、高选择性的17β-雌二醇检测方法具有重要的现实意义。

功能核酸适配体，是一类具有特定生物功能的核酸分子序列，通过指数富集配体的系统进化技术(SELEX)筛选而来，它能特异性的识别靶物质。近年来功能核酸已被广泛应用于生物传感等分子识别和应用研究领域,并对蛋白质、金属离子以及小分子等进行检测。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种检测17β-雌二醇的方法，所述的这种检测17β-雌二醇的方法解决了现有技术中检测17β-雌二醇的方法存在的机器昂贵、操作复杂、周期较长的缺点以及不稳定性、假阳性等技术问题。

本发明提供了一种检测17β-雌二醇的方法，包括以下步骤：

（1）一个制备17β-雌二醇功能核酸适配体的步骤，所述的功能核酸适配体为一段功能核苷酸序列，所述的功能核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示。

（2）在一定量适配体溶液中加入纳米金溶液，混匀孵育，使得适配体包裹在纳米金的表面，再加入待测17β-雌二醇的水溶液和丙磺酸缓冲液，混匀孵育，加入氯化钠溶液，再加入罗丹明B溶液，混匀后在570 nm波长处测定荧光信号强度来判断待测溶液中17β-雌二醇的含量。

进一步的，上述步骤(1)中，将功能核苷酸适配体配制成1 μmol/L的母液，步骤（2）中氯化钠配制成浓度为2 mol/L的母液、罗丹明B配制成500 μmol/L的母液。

进一步的，所述的纳米金通过以下方法制备：在100 mL煮沸的质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液中，加入3.5 mL质量百分比浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，搅拌30分钟，移除加热装置后继续搅拌混合物10分钟，最后，使溶液达到室温并且使用0.2 μm超滤膜过滤，然后储存在恒温为4℃的黑色玻璃瓶中备用。

进一步的，上述步骤(1)中，检测体系中功能核苷酸的终浓度为40 nmol/L，使用量为1 μmol/L的母液取20 μL，纳米金的使用量为100 μL，步骤（2）中，检测体系中氯化钠的浓度为140 mmol/L，使用量为2 mol/L母液取35 μL，罗丹明B的浓度为10 μmol/L，使用量为200 μmol/L母液取25 μL。

具体的，所述的检测17β-雌二醇的方法，还包括以下步骤：

（1）一个建立已知17β-雌二醇浓度的检测体系的步骤，取11支分别加入20 μL，1 μmol/L 17β-雌二醇功能核酸适配体的离心管，加入100 μL纳米金溶液，充分混匀后将离心管置于25℃条件下孵育20 min，然后分别加入10μL不同浓度的17β-雌二醇溶液和丙磺酸缓冲液，使得整个检测体系中17β-雌二醇溶液浓度维持在1000 nmol/L以下，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育20 min，在上述混合液中加入35 μL、2 mol/L的氯化钠溶液和25 μL、200 μmol/L的罗丹明B溶液，充分混匀，使得检测体系溶液总体积达到500 μL，留作以下测定用；

（2）另取1支离心管将17β-雌二醇溶液用10 μL超纯水替代，按照上述步骤(1)的方法处理后作为空白对照体系溶液；