[发明专利]一种海南捕鸟蛛毒素III的制备方法

说明书

技术领域

 本发明涉及固相多肽合成，尤其涉及一种海南捕鸟蛛毒素III的固相制备方法。

背景技术

 海南捕鸟蛛毒素III是从海南捕鸟蛛中分离的多肽类毒素分子，33个氨基酸残基，分子量3609 Da，三对二硫键，海南捕鸟蛛毒素III是一种TTX-S型钠通道抑制剂，对电压门控钠通道Nav1.7有高选择性抑制活性，海南捕鸟蛛毒素III有望开发成一种特异性Nav1.7电压门控钠通道抑制剂。

   电压门控钠通道Nav1.7在神经性疼痛和炎性疼痛传导过程中具有十分重要的作用，抑制电压门控钠通道Nav1.7的活性能够抑制痛觉的产生，因此，开发电压门控钠通道Nav1.7高选择性抑制剂有望产生镇痛活性强，毒副作用小的镇痛药。

   海南捕鸟蛛毒素III作为一种高特异性电压门控钠通道Nav1.7抑制剂，可望形成一种新型镇痛药物，然而，海南捕鸟蛛毒素III天然毒素获得十分困难，限制了其研究和应用，本发明提供一种大规模制备海南捕鸟蛛毒素III的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获得高活性的海南捕鸟蛛毒素III的固相多肽合成方法，以替代天然提取。

   为了实现以上目的，提供一种海南捕鸟蛛毒素III的制备方法，包括如下步骤：

A） 选用Rink Amide树脂，利用Fmoc氨基保护和侧链保护氨基酸为原料，按照海南捕鸟蛛毒素III的序列依次固相合成，第2位和第17位半胱氨酸采用Fmoc-Cys(Mmt)-OH；

B） 多肽序列合成完成后，采用1-3% TFA选择性去Mmt保护；

C） 采用空气氧化法在树脂上第2位和第17位半胱氨酸形成二硫键；

D）    90% TFA裂解树脂获得含一对二硫键多肽，制备色谱纯化，冷冻干燥；

E） 纯化的含一对二硫键多肽采用固相DTNB氧化复性，形成第二对和第三对二硫键；

F） 制备色谱纯化，冷冻干燥获得海南捕鸟蛛毒素III纯品。

   采用上述技术方案，通过固相多肽合成法合成海南捕鸟蛛毒素III，具有操作简单，成本低廉，产品回收率高等优点，适合大规模生产。

   作为本发明的进一步改进，所述步骤A）中，所用Rink Amide树脂替代度为0.3-0.8 mmol/g。

   作为本发明的进一步改进，所述步骤A）中，依次偶联采用的偶联剂为NMM/HATU/HOBt；每步的去Fmoc基团试剂为20%哌啶/DMF溶液。

   作为本发明的进一步改进，所述步骤B）中，采用1-3% TFA选择性去Mmt保护，去保护时间为30-10分钟。

   作为本发明的进一步改进，所述步骤C）中，采用空气氧化法在树脂上第2位和第17位半胱氨酸形成二硫键，反应缓冲液为0.1 M磷酸缓冲液，pH值为7.5，反应时间为24-96小时，反应程度采用DTNB检测，多肽树脂在DTNB溶液中不再变黄为反应终点。

   作为本发明的进一步改进，所述步骤D）中，裂解采用裂解试剂：90%TFA/5%苯酚/2.5%TIS/2。5%水，每克树脂加入3 mL裂解试剂，裂解时间2小时。

   作为本发明的进一步改进，所述步骤D）和F）中，纯化采用制备色谱纯化，色谱柱采用C18柱，柱温40℃。

   作为本发明的进一步改进，所述步骤E）中，采用固相DTNB氧化法，缓冲液为0.1 M磷酸缓冲液，pH值为7.5，复性时间通过复性率确定或者复性时间为24-96小时。

说明书附图

   图1为海南捕鸟蛛毒素III制备流程图。

具体实施方式

   下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

  Rink Amide树脂、各种保护氨基酸以及偶联剂均购自上海吉尔生化有限公司，说明书和权利要求书中所用英文缩写的含义见下表。

   实施例一 海南捕鸟蛛毒素III肽链的合成