[发明专利]一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法

权利要求书

1.一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，其特征在于，将一种转录因子基因--paired box 6（Pax6）基因，导入到大鼠脂肪间充质干细胞，诱导细胞发生转分化，形成角膜上皮样细胞。

2. 根据权利要求1所述的一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）采用载体PCDNA3.1(+)，构建paired box 6质粒，其中，paired box 6基因的ORF序列为：

ATGCAGAACAGTCACAGCGGAGTGAATCAGCTTGGTGGTGTCTTTGTCAACGGGCGGCCACTGCCGGACTCCACCCGGCAGAAGATCGTAGAGCTAGCTCACAGCGGGGCCCGGCCGTGCGACATTTCCCGAATTCTGCAGACCCATGCAGATGCAAAAGTCCAGGTGCTGGACAATGAAAACGTATCCAACGGTTGTGTGAGTAAAATTCTGGGCAGGTATTACGAGACTGGCTCCATCAGACCCAGGGCAATCGGAGGGAGTAAGCCAAGAGTGGCGACTCCAGAAGTTGTAAGCAAAATAGCCCAGTATAAACGGGAGTGCCCTTCCATCTTTGCTTGGGAAATCCGAGACAGATTATTATCCGAGGGGGTCTGTACCAACGATAACATACCCAGTGTGTCATCAATAAACAGAGTTCTTCGCAACCTGGCTAGCGAAAAGCAACAGATGGGCGCAGACGGCATGTATGATAAACTAAGGATGTTGAACGGGCAGACCGGAAGCTGGGGCACACGCCCTGGTTGGTATCCCGGGACTTCAGTACCAGGGCAACCCACGCAAGATGGCTGCCAGCAACAGGAAGGAGGGGGAGAGAACACCAACTCCATCAGTTCTAACGGAGAAGACTCGGATGAAGCTCAGATGCGACTTCAGCTGAAGCGGAAGCTGCAAAGAAATAGAACATCTTTTACCCAAGAGCAGATTGAGGCTCTGGAGAAAGAGTTTGAGAGGACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGGGAAAGACTAGCAGCCAAAATAGATCTACCTGAAGCAAGAATACAGGTATGGTTTTCTAATCGAAGGGCCAAATGGAGAAGAGAAGAGAAACTGAGGAACCAGAGAAGACAGGCCAGCAACACTCCTAGTCACATTCCTATCAGCAGCAGCTTCAGTACCAGTGTCTACCAGCCAATCCCACAGCCCACCACACCTGTCTCCTCCTTCACATCAGGTTCCATGTTGGGCCGAACAGACACCGCCCTCACCAACACGTACAGTGCTTTGCCACCCATGCCCAGCTTCACCATGGCAAACAACCTGCCTATGCAACCCCCAGTCCCCAGTCAGACCTCCTCATACTCGTGCATGCTGCCCACCAGCCCGTCAGTGAATGGGCGGAGTTATGATACCTACACCCCTCCGCACATGCAAACACACATGAACAGTCAGCCCATGGGCACCTCGGGGACCACTTCAACAGGACTCATTTCACCTGGAGTGTCAGTTCCCGTCCAAGTTCCCGGGAGTGAACCTGACATGTCTCAGTACTGGCCTCGATTACAGTAG；

另外，此构建的paired box 6质粒，还具有增强型绿色荧光蛋白标签和G418抗性，以利于质粒转染后阳性细胞的辨识和筛选；

（2）将大鼠脂肪间充质干细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔接种细胞数量为0.8×10⁵个，向孔内加入含10%体积胎牛血清、不含抗生素的低糖型DMEM培养基，并将培养板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中进行培养；

（3）目的基因导入细胞的方法：接种24h后，采用阳离子脂质体介导质粒DNA转染，使其形成含有上述质粒的混合液，并将其加入到上述培养板的培养孔中，每孔加入的DNA为0.5μg；混合液加入4～6h后，更换成含10%体积胎牛血清、不含抗生素的低糖型DMEM培养基，继续培养；

（4）48h后，将上述培养基换成含有600μg/ml G418的培养基，每3d更换一次培养基，10d后将存活的阳性细胞克隆在培养板盖上进行标记，刮除其他细胞，将培养基中的G418浓度降为300μg/ml，继续培养20d，挑选阳性克隆并采用有限稀释法筛选，筛选出的细胞，即为角膜上皮样细胞。