[发明专利]一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法。

背景技术

国家统计局第二次全国残疾人调查显示，中国因角膜病致盲患者约有400万人，并以每年约10％的比例增加。受限于角膜供体的紧缺，大量角膜盲患者得不到及时的治疗。研制组织工程角膜是科研人员及企业的迫切责任和任务，无论是社会效益还是经济效益都是巨大的，甚至不可估量。

组织工程角膜上皮来源的问题，是构建组织工程角膜的关键技术难点之一。建立一种安全高效的角膜上皮样细胞制造方法，将为组织工程角膜的研制与生产提供坚实基础。

使用脂肪间充质干细胞作为组织工程角膜上皮的种子细胞，具有较好的临床应用优势。脂肪间充质干细胞的安全性逐渐得到认可，它具备易于取材和培养的优势，具有多向分化潜能，更易形成商品化的临床产品。

本项目诱导间充质干细胞分化为上皮细胞，这种间质-上皮转变，使细胞趋向于成熟分化，更加稳定，提高了应用安全性，临床应用前景较佳。

发明内容

本发明的目的在于提供一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，用于构建角膜上皮。

本发明通过下述技术方案实现：

一种将大鼠脂肪间充质干细胞诱导成角膜上皮样细胞的方法，是将一种转录因子基因--paired box 6（Pax6）基因，通过脂质体介导，转染导入到大鼠脂肪间充质干细胞，此基因在细胞内表达，诱导细胞转分化，经过31天左右的时间，形成角膜上皮样细胞。期间，通过G418筛选的方法，挑选Pax6阳性表达的细胞，去除Pax6没有成功转染导入的细胞。

进一步地，具体包括以下步骤：

（1）采用载体PCDNA3.1(+)，构建paired box 6质粒，其中，paired box 6基因的ORF序列为：

ATGCAGAACAGTCACAGCGGAGTGAATCAGCTTGGTGGTGTCTTTGTCAACGGGCGGCCACTGCCGGACTCCACCCGGCAGAAGATCGTAGAGCTAGCTCACAGCGGGGCCCGGCCGTGCGACATTTCCCGAATTCTGCAGACCCATGCAGATGCAAAAGTCCAGGTGCTGGACAATGAAAACGTATCCAACGGTTGTGTGAGTAAAATTCTGGGCAGGTATTACGAGACTGGCTCCATCAGACCCAGGGCAATCGGAGGGAGTAAGCCAAGAGTGGCGACTCCAGAAGTTGTAAGCAAAATAGCCCAGTATAAACGGGAGTGCCCTTCCATCTTTGCTTGGGAAATCCGAGACAGATTATTATCCGAGGGGGTCTGTACCAACGATAACATACCCAGTGTGTCATCAATAAACAGAGTTCTTCGCAACCTGGCTAGCGAAAAGCAACAGATGGGCGCAGACGGCATGTATGATAAACTAAGGATGTTGAACGGGCAGACCGGAAGCTGGGGCACACGCCCTGGTTGGTATCCCGGGACTTCAGTACCAGGGCAACCCACGCAAGATGGCTGCCAGCAACAGGAAGGAGGGGGAGAGAACACCAACTCCATCAGTTCTAACGGAGAAGACTCGGATGAAGCTCAGATGCGACTTCAGCTGAAGCGGAAGCTGCAAAGAAATAGAACATCTTTTACCCAAGAGCAGATTGAGGCTCTGGAGAAAGAGTTTGAGAGGACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGGGAAAGACTAGCAGCCAAAATAGATCTACCTGAAGCAAGAATACAGGTATGGTTTTCTAATCGAAGGGCCAAATGGAGAAGAGAAGAGAAACTGAGGAACCAGAGAAGACAGGCCAGCAACACTCCTAGTCACATTCCTATCAGCAGCAGCTTCAGTACCAGTGTCTACCAGCCAATCCCACAGCCCACCACACCTGTCTCCTCCTTCACATCAGGTTCCATGTTGGGCCGAACAGACACCGCCCTCACCAACACGTACAGTGCTTTGCCACCCATGCCCAGCTTCACCATGGCAAACAACCTGCCTATGCAACCCCCAGTCCCCAGTCAGACCTCCTCATACTCGTGCATGCTGCCCACCAGCCCGTCAGTGAATGGGCGGAGTTATGATACCTACACCCCTCCGCACATGCAAACACACATGAACAGTCAGCCCATGGGCACCTCGGGGACCACTTCAACAGGACTCATTTCACCTGGAGTGTCAGTTCCCGTCCAAGTTCCCGGGAGTGAACCTGACATGTCTCAGTACTGGCCTCGATTACAGTAG。