[发明专利]一种用于检测牛GART突变基因型的引物对和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及一种用于检测牛GART突变基因型的引物对和检测方法。

背景技术

近几十年来，奶牛群体改良成效显著，通过对产奶性能的高强度选择，奶牛的产奶量、乳脂率、乳蛋白率等经济性状都得到了大幅提高。然而，人们在育种过程中对种公牛的选择总是局限在一部分优秀家系，导致奶牛的基因库在逐渐缩小。同时，人工授精技术的广泛使用，不仅使奶牛群体的近交程度不断增加，而且使群体内遗传缺陷基因快速扩散的风险也随之增大。自上世纪90年代以来，先后有多种遗传缺陷被报道，包括脊椎畸形综合征(CVM)、白细胞黏附缺陷(BLAD)、短脊柱综合征(BY)、遗传缺陷单倍型(HH1、HH2、HH3)等。这些缺陷基因呈隐性遗传模式，携带者表现正常，但如果缺陷等位基因纯合，将造成胚胎早期死亡、发育畸形、母牛流产或者死胎等，给奶牛养殖带来严重经济损失。因此，必须建立准确的检测手段，在群体中筛查遗传缺陷基因的携带者，通过逐步淘汰携带者，降低群体频率；同时，实施科学选配方案，避免携带者之间交配，从而防止出现遗传缺陷的纯合子。

2013年，法国科学家Fritz等报道荷斯坦品种奶牛中存在一种隐性致死遗传缺陷单倍型，命名为HH4，该单倍型纯合后，导致母牛因胚胎早期死亡而流产。统计分析发现，该遗传缺陷在法国荷斯坦牛群中的频率为3.6％。HH4的分子机理为，1号染色体的GART(GlycinAmide Ribonucleotide Transformylase protein，甘氨酰胺转甲酰基酶)基因编码区内的A/C突变，导致编码氨基酸从天冬酰胺突变为苏氨酸。由于GART在嘌呤的生物合成中起关键作用，发生突变后GART功能丧失，最终导致胚胎在妊娠早期死亡。

Fritz等(2013)报道了基于SNP单倍型的HH4检测方法。该方法需要首先对待检样本进行SNP芯片检测，然后通过统计学方法推断单倍型，进而判定个体携带HH4的概率。此方法不仅因依赖芯片检测而成本很高，同时还需事先建立参考群体的基因型数据库。

因此，亟需一种操作简单、准确高效筛查牛GART突变型等位基因携带者的分子检测方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测牛GART突变基因型的引物对和检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测牛GART突变基因型的引物对，所述引物对具体为：

上游引物GART-F：5’-GAAGGTGTCCTCTATGCTGG-3’；

下游引物GART-R：5’-TTTTAAGAAGTGGGAGGATC-3’。

本发明还提供了一种检测牛GART突变基因型的方法，所述方法包括以下步骤：

1)PCR扩增：以待测样本基因组DNA为模板，利用前述引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)扩增产物酶切：用限制性内切酶Mse I对PCR扩增产物进行酶切消化，得到酶切产物；

3)电泳检测：将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过观察酶切产物的电泳条带，判断待测样本的基因型。

进一步地，通过观察酶切产物的电泳条带是否存在长度为117bp的条带，判断待测样本是否为突变基因型。

进一步地，PCR反应体系以25μL计为：

进一步地，PCR反应条件为：95℃预变性8min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。

进一步地，酶切反应体系以20μL计为：

进一步地，酶切反应条件为：在水浴锅中37℃消化2小时。

进一步地，所述扩增产物在进行酶切之前，利用凝胶电泳检测长度为276bp的条带存在。该条带即为PCR扩增产物片段。

牛GART基因隐性有害突变携带者部分测序结果见图1，上述PCR扩增产物片段的野生型等位基因有3个Mse I酶切位点(见图2)，可进行酶切反应将276bp的片段切为4个片段，即154bp、59bp、58bp和5bp；突变型等位基因，由于A→C突变，导致1个酶切位点消失，从而只产生3个片段(154bp、117bp和5bp)。因此通过观察酶切产物是否存在117bp条带，即可筛查突变型等位基因的携带者。