[发明专利]一种抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物抗体免疫技术领域，具体是指一种抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备方法与应用。

背景技术

目前广谱抗生素在口腔致病菌的灭杀方面还存在较多缺憾，不仅不能实现特异性灭杀，而且有可能破坏益生菌，长时间使用的话还可能引起菌群失调，产生耐药菌；化学方法能够破坏口腔致病菌的结构，引起致病菌的死亡，但是对皮肤黏膜具有刺激作用；物理方法对口腔致病菌具有杀灭作用，但对人体皮肤黏膜有伤害。

卵黄抗体是禽类对特定抗原所产生的相应特异性抗体。卵黄抗体是一种天然存在、无残留、无毒副作用的免疫球蛋白，是抗生素的替代品。目前高免卵黄液广泛应用于一些疾病的紧急预防和治疗中。

现未见专门杀灭口腔致病菌的抗菌鸡卵黄抗体，且现有的制备鸡卵黄抗体的方法，是通过混合抗原然后进行免疫，从而获得的抗体，但由于母鸡机体存在较大差异，其能够分离提取的鸡卵黄抗体对单种菌的灭杀效果无法保证，难以实现工业化生产。

现有制备卵黄抗体的方法中，所选取的免疫鸡为经过挑选、检查和进行了某些疫病的预防接种的健康产蛋母鸡，仍存在一些鸡源性的细菌或/和病毒混存于鸡蛋中，进而影响鸡蛋中的鸡卵黄抗体，如大肠杆菌、沙门氏菌、鸡减蛋综合征病毒、鸡禽白血病病毒等，很容易影响到抗体的安全性。目前，一些研究选用带有毒性的甲醛、二乙烯胺（BEI）及β-丙内酯（BPL）作灭活剂，对鸡卵黄抗体中外源性病毒具有灭活效果，但对鸡卵黄抗体的活性有影响，非常不利于鸡卵黄抗体发挥效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直接作用于人口咽部，可在短时间与口腔致病菌的特异性病原体结合，能够较长时间有效杀灭特异性口腔致病菌，且安全性能较好，使用人群更为广泛的抗菌鸡卵黄复合抗体。

本发明另一个目的在于提供抗菌鸡卵黄复合抗体的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供抗菌鸡卵黄复合抗体在抗口腔致病菌方面的应用。

本发明通过下述技术方案实现：一种制备抗菌鸡卵黄复合抗体的方法，包括以下步骤：

（1）分别制备口腔致病菌的免疫抗原，口腔致病菌包括溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌；

（2）将健康母鸡分群，分别对每群健康母鸡免疫一种口腔致病菌的免疫抗原；

（3）分别收集每群免疫母鸡所产的免疫鸡蛋，并分别对免疫鸡蛋的蛋黄进行提取、纯化、分离，从而获得各单种菌的抗体原液；

（4）各单种菌的抗体原液按照抗体效价检测进行混合，并配加稳定剂制成抗菌鸡卵黄复合抗体。

本发明的制备口腔致病菌菌灭活后，分别稀释、乳化制成各单种菌免疫抗原；用该抗原注射免疫产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋，经消毒、蛋黄蛋白分离，取蛋黄，水稀释法提取、离心分离获得水溶性组分，用硫酸铵提取获得各单种菌鸡卵黄抗体粗提物；将粗提物用缓冲液溶解后，超滤纯化；将超滤液灭活；根据单价抗体效价检测结果，配制多种菌群口腔卵黄抗体，经除菌过滤后加适量稳定剂制成溶血性链球金黄色葡萄球菌、白色念珠菌大肠杆菌卵黄抗体成品。本品每毫升含相应特异病原抗体效价不低于1:16。主要用于人口咽部粘膜的相应病原体的预防。

为了更好的实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（1）中，制备口腔致病菌的免疫抗原的具体过程为：

（1.1）从急性扁桃体炎患者炎症部位的咽拭子处获得口腔致病菌，接种于10％的新鲜羊血的血平板或沙保培养基；

（1.2）通过患者炎症部位症状判断，并经革兰染色形态观察、梅里埃鉴定仪和16sRNA全长测序确认，口腔中的主要致病菌包括乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌；

（1.3）分别扩大培养上述四种口腔致病菌，并调整细菌浓度为2×10⁹；

（1.4）将上述四种扩大培养的口腔致病菌均分成两份，一份通过0.5%甲醛溶液灭活24小时，另一份采用相应物理方法裂解相应的细菌：①大肠杆菌采用超声破碎法；②乙型溶血性链球菌采用组织裂解仪共振裂解：2mlEP管中加入菌悬液和50-200μm玻珠50μg，以25Hz振动5分钟，共振2-3次；③金黄色葡萄球菌采用研磨破碎；④白色念珠菌采用组织匀浆器裂解；

（1.5）将灭活和裂解的相同种类的口腔致病菌按1：1比例混合，即得该种口腔致病菌的免疫抗原；

（1.6）根据步骤（1.5）所述，分别获得四种口腔致病菌的免疫抗原。

为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤（2）中，母鸡具体的免疫过程为：