[发明专利]一种螺旋藻类食品中微囊毒素的快速定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种螺旋藻类食品中微囊毒素的快速定量检测方法。

背景技术

目前主要的食用藻类主要有螺旋藻及小球藻。螺旋藻类含有丰富的营养成分，包括多种维生素( B1、B2、B6、B12、C、E、K 等)、矿物质( 钙、铁、锌、磷、镁和碘等)、氨基酸、β-胡萝卜素、γ -亚油酸、叶绿素及蛋白质。世界卫生组织( WHO)定为“ 人类 21世纪的最佳保健品” , 1981 年美国食品和药品管理局( FDA) 确认其为“最佳蛋白质来源之一”, 我国卫生部也批准其为“ 新资源食品”。 ，目前，国内外对螺旋藻进行过系统的安全性毒理学评价, 确认它是安全有效健康的食品。 随着人民生活水平及保健意识的提高, 人们对保健食品的需求越来越大, 同时对保健食品安全性也提出了更高的要求。而螺旋藻在人工养殖和自然环境中， 都可能被有毒蓝藻污染，伴生一类可对人类肝脏发生损害的微囊藻毒素。微囊藻毒素是一种单环 7 肽， 至 21 世纪初已确定的 MCYSTs 的同分异构体已达 60 多种，是在蓝藻水华污染中出现频率最高、 产毒量最大的一类藻类毒素， 其具有强烈的促癌作用，其作用的靶器官是肝脏， 它能强烈地抑制蛋白磷酸酶的活性， 导致细胞内多种蛋白质的过磷酸化， 导致肝细胞的损伤。由于其生态毒理学效应， 日益引起人们的关注。近年来，由于全球环境污染加重，通过产毒微囊藻和其它有害蓝藻污染的水体暴露微囊藻毒素是人类面临的一个公共卫生问题。一些国家和WHO 还推荐了饮用水和娱乐用水中微囊藻毒素的安全限量标准，因此，如何有效检测混在螺旋藻中的微囊藻毒素的含量对于我国对藻类保健品的质量监管至关重要。

目前，微囊藻毒素的检测方法包括蛋白磷酸酶抑制分析PPIA法、 ELISA 法及 HPLC 法，PPIA法、 ELISA 法在检测过程中易受干扰，HPLC 法检测过程中样品前处理复杂。为此，本发明提供一种检测灵敏度高，定量准确的超高效液相色谱-串接质谱检测方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种检测灵敏度高、抗干扰性强及检测结果准确的螺旋藻类食品中微囊毒素的检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种螺旋藻类食品中微囊毒素的快速定量检测方法,包括以下步骤：

（1）样品前处理：取螺旋藻固体样品1-5g，置于碾钵中研碎后加提取溶剂，放入磁力搅拌器中搅碎，离心，沉淀后用GF/C滤纸过滤，再次加入提取液，重复提取3-5次，将提取液置于旋转蒸发仪上加温浓缩，得样品待测液备用；

（2）制备阳性对照液：取微囊毒素RR 和微囊毒素LR 标准品1-5g，加超纯水溶解配制成1.0ug/ml的阳性对照溶液备用；

（3）样品净化：将步骤（1）中制备的样品待测液加入HLB柱中进行富集，洗脱，收集洗脱液置于烧瓶中，于旋转蒸发仪上蒸干，再次富集，再次洗脱，并将洗脱液于旋转蒸发仪上蒸干，取蒸干后的样品加入3-5倍体积的甲醇，转入离心管中，加5-10ml纯化水溶解，离心，取上清液待测；

（4）HPLC测定样品中微囊毒素的含量：将步骤（2）中配制好的1.0ug/ml的阳性对照溶液分别进行一级全扫描与二级全扫描机多反应检测，优化色谱条件与质谱条件，对步骤（3）中的待测上清液进行HPLC-串接质谱法测定。

优选的，步骤（1）中所述的螺旋藻固体样品剂型包括胶囊、片剂及精粉。

优选的，步骤（1）中所述的提取溶剂的加入量为30-50ml。

优选的，步骤（1）中所述的提取溶剂选自冰醋酸或醇溶液中的一种或多种。

优选的，步骤（1）中所述的冰醋酸为体积浓度为5-10%的冰醋酸。

优选的，步骤（1）中所述的醇溶液为丁醇、甲醇和水的混合溶液，所述的丁醇、甲醇、水的体积比为（1-3）：（4-12）：（20-50）。

优选的，步骤（1）与步骤（3）中所述的离心速度为10000-12000r/min，离心时间为20-30min；步骤（1）中所述的加温温度为50-80℃。

优选的，步骤（3）中所述的洗脱过程具体为：先用20-30%的甲醇水溶液洗脱，再用90-100%的甲醇水溶液洗脱。

优选的，步骤（3）中再次洗脱过程具体为：先用浓度为10-20%的甲醇水溶液洗脱，再用60-70%的甲醇水溶液洗脱。