[发明专利]温度敏感型载体pBBR1MCS‑2‑Ts3及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中温度敏感型载体pBBR1MCS-2-Ts3及其应用。

背景技术

把一段有用的目的DNA片段通过DNA重组技术，送进受体细胞中去进行复制和表达的工具叫载体(Vector)。质粒是重组DNA技术中常用的载体，质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。一个理想的载体大致应有下列一些特性：(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型；(2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点；(3)能插入较大的外源DNA片段；(4)具有遗传标记，便于鉴定和筛选；(5)对宿主细胞无害。

宽宿主质粒pBBR1MCS-2是应用性很广的载体，该质粒由pBBR1质粒改造而来。pBBR1质粒来源于革兰氏阴性菌Bordetella bronchiseptica S87(Antoine R and Locht C.Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from Gram-positive organisms.Mol Microbiol.1992,6(13):1785-1799)。pBBR1MCS-2含有一个卡那霉素(kan)抗性筛选标记，它的大小仅有5145bp，这些特性使得该质粒适用于DNA克隆、蛋白表达，广泛用于革兰氏阴性菌的分子操作。

温度敏感型质粒载体可以方便的控制质粒在宿主中的存在。当温度比较低时，质粒可以存在宿主中，而当温度提高后，温度敏感型质粒载体将丢失或整合到染色体上。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何构建温度敏感型载体。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了构建重组载体的方法。

本发明所提供的构建重组载体的方法，为构建重组载体的方法1，是将SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替换为目的基因表达盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不变，得到的重组DNA即为所述重组载体，将该重组载体命名为pBBR1MCS-2-Ts3；

所述目的基因表达盒编码的蛋白质为将SEQ ID No.2所示的蛋白质进行A3)的改造、保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基均不变得到的蛋白质得到的蛋白质，即所述目的基因表达盒编码的蛋白质为SEQ ID No.8所示的蛋白质；A3)为将SEQ ID No.2第86位的Arg突变为Cys。

上述方法1中，所述目的基因表达盒中的目的基因为将SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子进行B3)的改造、保持SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子；B3)为将SEQ ID No.1第2049位的C突变为T。

其中，SEQ ID No.1由5145个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第1794-2456位核苷酸为rep的编码基因，编码SEQ ID No.2所示的rep蛋白。

上述方法1中，所述目的基因表达盒的序列可为SEQ ID No.7。

其中，SEQ ID No.7的第238-900位编码SEQ ID No.8所示的蛋白质。

上述方法1中，所述目的基因表达盒中启动所述目的基因表达的启动子为将SEQ ID No.1的第1557-1793位所示的DNA分子进行如下C2)、C3)和C4)这三种中至少一种的改造、保持SEQ ID No.1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不变得到的DNA分子：

C2)如下C21)和/或C22)：

C21)将SEQ ID No.1第1732位的A突变为G；

C22)将SEQ ID No.1第1780位的G突变为T；

C3)如下C31)和/或C32)：

C31)将SEQ ID No.1第1747位的C突变为T；

C32)将SEQ ID No.1第1776位的T突变为A；

C4)将SEQ ID No.1第1751位的T突变为A；