[发明专利]EV713C蛋白酶作用靶点检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，及检测方法。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是手足口病的主要致病原之一。临床上多表现为轻微症状：发热、手足口部的疱疹、疱疹性咽峡炎。而严重者则引起神经系统并发症如无菌性脑膜脑炎、脊髓炎、神经源性的肺水肿等。严重者有生命危险。临床上治疗EV71感染主要是对症治疗，目前尚无特异抗病毒药物，寻找和发现抗EV71病毒药物是目前面临的中药课题。

寻找抗EV71药物目前主要有2大途径：1：在已知病毒蛋白功能域的基础上进行针对性设计；2：在中草药、海洋生物、陆地微生物等自然界中萃取、寻找。后者往往是新结构、新机制抗病毒药物的重要来源，对于抗病毒药物的研究具有重要意义，但是，这些自然资源中获得的化合物的抗病毒作用靶点却常常存在难度。因此，寻找靶点并开发一套合适的检测方法是急需解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明以3C蛋白为抗病毒作用靶点，开发了一套检测试剂盒及检测方法，其目的是检测待检测化合物是否可抑制3C蛋白，进而判断其是否可抑制EV71病毒，是否可以作为抗EV71病毒的药物进行研究应用。

3C蛋白是手足口病病原EV71的蛋白酶，其酶活性直接影响病毒复制效率和致病毒力(Weng K.F.，Li M.L.，Hung C.T.et al.Enterovirus 7 l 3C protease cleaves a novel target CstF-64 and ihibits cellular polyadenylation[J].PLOS Pathog，2009，5(9)：elO00593.)。本研究以该蛋白酶测活方法为基础，建立了3C蛋白酶活性的成套试剂，用于检测药物靶点。如果药物可以抑制3C蛋白酶的活性，则提示该药物的作用靶点是EV71的3C蛋白酶的酶活中心(His41,Glu71和Cys147催化三联体)。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测试剂盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反应缓冲液，所述3C蛋白的序列如下(如SEQ ID NO.1所示)：

GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVNLELTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPVGDVVQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQCGGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQ。

所述多肽底物为Dabcyl-EALFQGPPKFE-Edans，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，N端连接Dabcyl基团，C端连接Edans基团。

所述酶解反应缓冲液为反应buffer液，其包括如下组分：25mM Tris-HCl(pH 8.0),200mM NaCl。

一种EV71 3C蛋白酶作用靶点检测方法，如下：将待检测化合物、3C蛋白加入到酶解反应缓冲液中，然后加入多肽底物，混匀，反应30min后，在336nm波长激发下，检测其在490nm处的荧光强度；若检测不到荧光，则表明该待检测化合物能抑制3C蛋白，具有抗EV71病毒能力，可作为抗EV71病毒的药物进行进一步的研究应用；若能够检测到荧光，则表明该待检测化合物不能抑制3C蛋白。

进一步地，检测方法如下：多肽底物在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值A(表示未降解时的荧光强度)。将3C蛋白多肽底物加入到反应buffer液后，混匀反应30min后，倒入玻璃比色皿中，在336nm波长激发下，获得其在490nm处的荧光强度值B(经降解后的荧光强度)。在上述反应体系中加入一定浓度的待检测化合物，并重复以上步骤操作，获得化合物存在时的荧光强度C，通过比较A,B,C三值大小，确定化合物对3C蛋白酶的酶活性的影响(C的数值在A、B之间，C的数值越小，说明待检测化合物对3C蛋白酶的酶活性的抑制越明显，C的数值越大，说明待检测化合物对3C蛋白酶的酶活性的抑制越弱)。