[发明专利]一种结核分枝杆菌细胞破碎方法

说明书

 技术领域：

    本发明属于分子诊断医药领域，尤其是涉及一种利用化学试剂和立体超声波提取RNA的结核分枝杆菌细胞破碎方法。

技术背景：

    结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器．以肺部结核感染最为常见。回顾性调查结果显示，我国结核病的误诊率可达24.1％，所以，提高实验室检测能力，促进早谚断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。RNA在细胞中含量大，且易降解，既可作为活菌检测的标志物，又可提高检测灵敏度，可作为结核分枝杆菌检测的理想标志物。在实验前，需对用于检测的痰液样本进行前处理，破坏细胞释放RNA分子用于检测，于此同时，还需保证目标RNA分子的活性，确保此过程中RNA分子结构稳定。

    目前市场上常用的生物医疗方面的破碎方法可归纳为化学法和机械法两大类。

    化学法包括渗透压冲击破碎法、酶溶破碎法等，一般均需要使用大量的化学试剂。化学试剂应用的优势是破碎效率高，但存在两个方面的不足：一是不容易控制实验操作的进程．对于操作环境的要求较高，实验结果不够稳定：二是化学试剂属于常规易消耗的试剂，加大了检测实验操作的成本，增加了医疗患者的检测负担；三是大量的化学试剂易产生环境污染。

机械法包括高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法、超声波破碎法等，  一般均不需要使用化学试剂。机械破碎法不但降低了使用化学试剂的高额成本．还减小了环境污染的风险，具有操作简单、成本低、绿色环保的优点。目前的机械破碎法如高压匀浆破碎法提取的对象是细胞内的蛋白质，并不能提取出细胞内的RNA。高速搅拌珠研磨破碎法、超声波破碎法的提取对象是RNA．但仅使用机械破碎法进行细胞破碎时，破碎程度不宜掌握．功率选择低时，细胞破碎不够完全，不能很好地提取出细胞内的RNA；但功率选择过高时，会破坏细胞内的RNA分子结构。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌细胞破碎方法，其具有操作简单、成本低廉、可靠性高、安全性好、环境污染小的优点，可应用于结核分枝杆菌的快速提取和检测判断。

本发明在采集的痰液样本中加入氢氧化钠溶液，通过震荡混匀，去除痰液样本表面的粘蛋白成分，降低样本的粘性，再经过高速离心处理，提取出样本中的结核分枝杆菌细胞，便于后期的处理和检验。

    将待测样本放入超声波破碎装置，加入超声介质为水(温度为常温)，超声破碎15分钟，借助介质传播的超声能量，破坏结核分技杆菌细胞结构，释放出RNA；所述的化学破碎法使用的氢氧化钠溶液质量百分浓度为1％～10％；所述的机械破碎法超声波破碎装置的超声额定功率为200～350w，频率20～60 KHz，功率调整范围为额定功率的0～100%，超声介质水的温度在55℃以下，优选为常温。

   超声破碎是利用超声对细胞的热效应、机械效应和空化效应。热效应是超声在水介质中传播时，介质分子之间的摩擦力阻碍了超声波引起的分子震动，使部分传递的能量转化为热能，直接效果就是传递介质的温度缓慢上升，满足结核分枝杆菌细胞破碎适宜的温度条件。机械效应是利用超声波的原发效应，即在介质中传播时介质质点交替地收缩和伸张构成了压力变化，引起细胞结构损伤。空化效应是细胞在超声波的传递中，生物内形成大量的气泡，气泡随着超声震动和不断地聚爆而产生出机械剪切压力和能量，同时气泡爆破时产生瞬时的5000℃高温、5MPa高压，使水蒸气热解离导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。

    本发明具体以下优点：

    1、本发明同时使用化学破碎法和机械破碎法，具有操作简单、成本低廉、可靠性高、安全性好、环境污染小的优点。

2、化学破碎法进行痰液采集样本的前处理，使用普遍的氢氧化钠溶液加入至样本中，通过震荡混匀后高速离心处理，即可从采集样本中提取出结核分枝杆菌细胞，操作简单快捷、成本低廉。

3、机械破碎法是对已经完成前处理的结核分枝杆菌细胞进行细胞破碎，采用超声波破碎法对细胞的热效应、机械效应和空化效应，给予适宜的破碎温度和细胞破碎功率，释放出RNA，安全高效。

具体实施方式： 

以下实施例仅用于更加清楚地说明本方面的技术方案，而不能以此来限制本说明的保护范围。

本发明的破碎法是化学法和机械法的融合，首先采用化学破碎法进行采集痰液样本的前处理，提取出样本中的结核分枝杆菌细胞，再使用机械法超声波破碎细胞的细胞结构，释放出RNA，具体实施步骤：

    (1)取脓样、干酪样或脓性粘液样性质的痰液样本；