[发明专利]交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品化学技术领域，尤其涉及一种交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方法。

背景技术

固定化脂肪酶是将脂肪酶通过物理或化学的方法与某种物体结合制备成为不溶于水的，但仍具有催化活性的复合体，这一过程是将单体的游离脂肪酶转变成了被某种物体束缚的复合脂肪酶催化剂。

脂肪酶（EC3.1.1.3）在自然界中广泛存在，工业领域的脂肪酶主要运用于化工、医药、食品等，来源于微生物中。在酶催化反应中，脂肪酶在油水界面具有“界面活性”的特点，共同的催化活性中心-即Ser、Asp（Glu）和His构成的三联体，包埋于一个或数个带色氨酸（两亲性）的α-螺旋结构的“盖子”保护之下，色氨酸疏水面与催化中心疏水结构相结合，亲水部分则暴露于外，当与界面接触时，“盖子”被打开，活性中心暴露，底物得以靠近，同时，酶分子仍然存在一定数量的水，保证其在油水界面的自体激活。因此，两亲性物质如磷脂、或胆酸盐等的存在对加速脂肪酶的界面活化具有重要作用。

脂肪酶的固定化方法大致分为物理法和化学法：物理法包括吸附法和包埋法；化学法包括交联法和共价结合法。交联法是利用交联剂对晶体酶或溶解酶交联后就形成能保持一定催化活性的交联酶。

中国发明专利CN102286452B公开了一种采用油酸包裹的Fe₃O₄纳米结构，通过与烯酸酯的聚合，然后与水合肼、亚硝酸依次反应得到活化的叠氮磁性纳米结构的固定化酶载体。由于固定化酶载体是在油酸包裹粒子在烯酸脂中进行共聚反应而进行的包埋，具备的孔隙，使得叠氮化反应中的NaNO₂、引发剂过硫酸钾等能够对以Fe₃O₄为核的油酸包裹粒子造成破坏，导致功能的缺陷。

中国发明专利CN103012673B提供了一种生物酶固定化的核壳式超顺磁性聚合物微球的制备方法，用具备较强轻水性的SiO₂对Fe₃O₄纳米粒子进行完全包裹，再将表面引入环氧基团的聚合物，此类固定化酶虽然能够较好的保留酶活，装载量有一定的优势，然而仅仅能运用于水溶性生物化酶的固定，无法适应脂肪酶界面活化特性。

发明内容

由于脂肪酶的特殊结构和固定化基团的特殊属性，固定化的脂肪酶通常刚性结构增加，通常在一些疏水性载体上表现出更好的活性。本发明目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方法，该超顺磁载体是基于脂肪酶界面活性作用方式的超顺磁聚合微球，通过该微球对脂肪酶进行固定，固定化的脂肪酶具备良好的磁分离性能，保留90%以上的酶活性，克服酶促反应中脂肪酶活依赖界面效应的劣势。

本发明通过以下技术方案来实现：一种交联固定脂肪酶的超顺磁载体的制备方法，经过下列各步骤：

（1）纳米磁性微球Fe₃O₄的制备：

将FeCl₃·6H₂O溶解于无水乙二醇中，配置成浓度为0.1～0.15mmol/mL的溶液，再按FeCl₃·6H₂O与处理剂的质量比为1:（4～6）加入处理剂，其中处理剂为乙酸钠和聚乙二醇，加入处理剂后使乙酸钠的浓度为80～120mg/mL，然后在200℃下恒温超声反应4～6h，待自然冷却后，用乙醇和去离子水洗涤数次，再经真空干燥即得纳米磁性微球Fe₃O₄；

（2）纳米磁性微球Fe₃O₄的包裹：

将步骤（1）所得纳米磁性微球Fe₃O₄与浓度为1mol/L的NaOH溶液混合，直至得到纳米磁性微球Fe₃O₄的浓度为4～8mg/mL的悬浮液，将悬浮液经超声波分散均匀，然后加入3倍悬浮液体积的无水乙醇、加入纳米磁性微球Fe₃O₄质量1/5～1/10的包埋剂以及加入悬浮液体积1/2的氨水，再在100℃下搅拌反应40min得到磁流体，然后将磁流体在1～2T的磁场条件下静置完成磁分离，再对磁流体进行固液分离，所得固体用乙醇和去离子水洗涤数次，即得包裹后的纳米磁性微球Fe₃O₄；

（3）纳米微球的功能化修饰：