[发明专利]一种水蛭素冻干粉针剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于中药制药技术领域，具体涉及一种水蛭素冻干粉针剂的制备方法。

背景技术

水蛭是我国传统中药，1800年前《神农本草经》中就有记载。中医认为它有破血、逐瘀、通经的疗效，主要用于治疗瘕症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤。西方也常用水蛭吸血以治疗某些疾病。从水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分，水蛭素是其中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65-66个氨基酸组成的下分子蛋白质（多肽）。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现的最强的凝血酶天然特异抑制剂。动物是呀与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶③往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致手术失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50＞50mg/kg，远大于治疗所用的剂量（1mg/kg）。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用。近几年，研究重组水蛭素的越来越多，但是，重组水蛭素与天然水蛭素相比存在两方面天性的缺陷：一方面，重组水蛭素虽然在氨基酸序列和结构与天然水蛭素极其相似，但在63位络氨酸残基上硫基的缺失，使重组水蛭素对凝血酶的抑制常数比天然水蛭素降低了90%；另一方面，一个重要的原因是水蛭素良好的药用效果不仅仅在于水蛭素的作用，还有水蛭唾液中的其他活性成分的参与作用共同形成的。这些是重组水蛭素与生俱来无法克服的先天缺陷，使其进行深入的开发应用加大了难度。

凝血酶是导致血栓的主要因素之一，而血栓的形成是导致心脑血管疾病的主要原因。心脑血管疾病是目前危害人类生命和健康的主要疾病之一，据世界卫生组织（WHO）统计，全世界每年大约有1700万人死于心脑血管病，即全球每3个死亡者中就有1个死于心脑血管疾病。预计到2020年，因心脑血管疾病死亡的人数将比该数字增加50%，高达2500万人。我国60岁以上人口哦已过亿，这个年龄层次病发率每年在5%以上，即我国每年有500万人需用抗凝药物来防治和治疗心脑血管疾病，并且这类疾病已经向年轻化发展。若按1%人数计算，发病率的基数会更大。

专利申请号为031143566的专利公开了提取纯化水蛭素的方法，该方法是从活体水蛭的唾液分泌物中用丙酮提取水蛭素，再用柱层析法进行纯化，只应用了阴离子交换柱层析（凝胶过滤柱层析只是分子筛的作用）进行纯化，杂质没有完全分离，水蛭素的纯度不高，也未见该专利关于水蛭素纯度的报道；申请号为95117701的专利公开了采用亲和色谱法纯化水蛭素，但在实际应用过程中，只适用于实验室，才能进一步中试放大和生产，不利于产业化推广。

发明内容

基于上述原因，本发明提供一种水蛭素冻干粉针剂的制备方法，采用超滤、阴离子交换、阳离子交换柱层析法进行除杂，再用透析袋浓缩法去除提取过程中产生的盐类物质，指水蛭素的纯度大大提高。

为达到上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种水蛭素冻干粉针剂的制备方法，包括以下步骤：

(A)取水蛭，加入注射用水，洗去杂质后破碎，制成匀浆；将匀浆分装于有盖容器中，于-30℃冰柜冻结20-24小时，再用乙醇解冻，再次冻结，反复冻、融3-5次，最后一次解冻后，加氯化钠溶液，搅拌，再用冷冻离心机离心沉淀，吸取上清液备用；

(B)将上清液进行超滤，超滤至原溶液体积的1/3-1/2时，加水至原体积，反复操作3-5次，合并透过液，20℃下浓缩至相对密度为1.05-1.10的溶液；