[发明专利]糖蛋白的产生

说明书

本申请是申请日为2007年7月11日、发明名称为“糖蛋白的产生”的中国专利申请200780033112.5(国际申请号PCT/US2007/015767)的分案申请。

本发明涉及在包含锰的细胞培养基中产生糖蛋白的方法，和用于这种方法的细胞培养基。

相关申请的参考

本申请是2006年7月13日提交的美国临时专利申请号60/830,658的共同待决申请，并且与其有至少一个共同发明人并且要求该美国临时专利申请的优先权，将该美国临时专利申请的内容完整引入本文作为参考。

发明背景

蛋白质和多肽已经成为越来越重要的治疗剂。在多数情况下，这些蛋白质和多肽在细胞培养物中从细胞产生，所述细胞已经被人工改造和/或选择以产生不寻常的高水平的特定目的蛋白质或多肽。细胞培养条件的控制和优化对于蛋白质和多肽的成功的商业化生产是尤其重要的。

细胞培养物中产生的许多蛋白质和多肽是糖蛋白，其含有共价连接的糖类结构，包括寡糖链。这些寡糖链在内质网和高尔基体中通过N-连接或O-连接连接到蛋白质。寡糖链可以占糖蛋白质量的大部分。认为寡糖链在糖蛋白的功能中起重要作用，包括促进糖蛋白的正确折叠、介导蛋白质－蛋白质相互作用、赋予稳定性、赋予有利的药物动力学和/或药物代谢动力学性质、抑制蛋白酶解消化、将糖蛋白靶向正确的分泌途径和将糖蛋白靶向一个或多个特定器官。

通常，在内质网腔中，N-连接的寡糖链加入新生的转运蛋白(见Alberts等人,Molecular Biology of the Cell,1994，引入本文作为参考)。寡糖被加入目标共有序列Asn-X-Ser/Thr内所含的天冬酰胺残基侧链上的氨基上，其中X可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。最初的寡糖链通常在内质网中被特定糖苷酶修剪，得到由两个N-乙酰葡糖胺和三个甘露糖残基组成的短的分枝的核心寡糖。

糖蛋白在内质网中的最初处理后，通过小泡穿梭到高尔基体中，在那里寡糖链经历进一步的加工后被分泌到细胞表面。经修剪的N-连接的寡糖链可以通过加入几个甘露糖残基修饰，得到高甘露糖寡糖。备选地，N-乙酰葡糖胺的一个或多个单糖单位可以加入核心甘露糖亚基形成复杂的寡糖。半乳糖可被加入N-乙酰葡糖胺亚基，唾液酸亚基可被加入半乳糖亚基，得到以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺残基的任一个结束的链。此外，岩藻糖残基可以加入核心寡糖的N-乙酰葡糖胺残基。这些加入的每一种通过特定糖基转移酶催化。

除了通过N-连接的糖基化途径修饰外，糖蛋白也可通过向特定丝氨酸或苏氨酸残基加入O-连接的寡糖链被修饰，如它们在高尔基体中被处理那样。O-连接的寡糖的残基每次加入一个并且每个残基的加入通过特定酶催化。O-连接的糖基化的共有氨基酸序列不如N-连接的糖基化意义明确。

蛋白质糖基化的最终质量和程度受到细胞培养条件的显著影响。例如，常规的分批和补料分批培养方法集中于所产生的肽的最终水平并且通常导致产生这样的糖蛋白，所述糖蛋白具有较不广泛的糖基化模式和/或这样的糖基化模式，其寡糖链的糖残基没有足够地反映存在于天然发生形式的糖蛋白中的糖残基。增加糖基化程度和/或调节糖残基的组成到更接近地反映存在于天然形式糖蛋白中的糖基化水平和组成可以潜在地导致这样的治疗性糖蛋白物质，其具有更高的功效、改进的药物代谢动力学和/或药物动力学性质和更少的副作用。尽管在提高细胞培养物中产生的糖蛋白的糖基化的质量和数量方面做出了一定的努力，但是仍然需要额外的进步。尤其需要开发通过在确定成分培养基中培养细胞产生具有改进的糖基化模式的糖蛋白的系统。

发明概述

本发明的方法和组合物提供了用于用细胞培养大规模产生具有改进的糖基化模式的糖蛋白的改进系统。例如，在一些实施方案中，本发明提供了商业规模(例如，500L或更多)培养方法，其利用含有约10到600nM之间的锰的摩尔累积浓度的培养基。在一些实施方案中，培养基中的摩尔累积谷氨酰胺浓度小于约8mM。在一些实施方案中，培养基中的摩尔累积谷氨酰胺浓度小于约4mM。将理解如上面使用的“累积”指在细胞培养过程中加入的具体一种或多种组分的总量，包括培养开始时加入的组分和随后加入的组分。在本发明的一些实施方案中，希望随时间减小培养的“进料”，因此希望最初存在的量最大。当然，如果那些组分在不同时间加入(例如，最初存在的所有组分对通过进料加入的一些组分)，那么培养基组分在培养期间被代谢使得具有相同累积量的给定组分的培养物将具有不同的绝对水平。