[发明专利]一种固液结合制备利拉鲁肽的方法

说明书

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种采用固液相结合的化学方法制备利拉鲁肽的方法，本发明能够简化利拉鲁肽的制备工艺，提高终产品的质量标准；本发明首次合成二肽单体Fmoc‑Lys(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑Boc)‑OtBu)‑OH,并将其用于利拉鲁肽的制备，同时采用Fmoc‑Ala‑Ala‑OH参与制备利拉鲁肽，避免了24位或25位缺失Ala杂质肽的生成，降低了纯化难度，提高了收率；三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)水溶性较好，利于反相色谱纯化制备，同时还保护了N端的氨基在棕榈酸修饰过程中不发生副反应，极大的提高了终产品的收率；本发明的实施，解决了化学合成利拉鲁肽过程中终产品相关杂质肽超标、总收率低的难题，得到纯度大于99.5%，单杂小于0.1%的终产品，降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及多肽药物制备方法领域，特别涉及一种固相和液相结合制备利拉鲁肽的方法。

背景技术

利拉鲁肽(Liraglutide)，商品名Victoza，由丹麦诺和诺德公司研发，于2010年1月25日在美国上市，2011年3月4日获SFDA批准，进入中国市场；用于成人2型糖尿病患者控制血糖，适用于单用二甲双胍或磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，与二甲双胍或磺脲类药物联合应用。2014年12月23日，诺和诺德公司又推出用于治疗肥胖的Saxenda(商品名)，剂量为3mg/天。

利拉鲁肽是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有97%的序列同源性，人GLP-1可以结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。与天然GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射给药后，其作用时间延长的机理包括:使吸收减慢的自联作用；与白蛋白结合；对二肽基肽酶IV (DPP-IV)和中性内肽酶(NEP)具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。

利拉鲁肽化学表述为Arg³⁴Lys²⁶-[N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基))]-GLP-1^7-37，分子式为C₁₇₂H₂₆₅N₄₃O₅₁，相对分子质量为3751.2，CAS号为204656-20-2，序列信息如下：

目前，诺和诺德公司(US6458924和US6268343)主要通过基因重组技术，利 用酵母生产利拉鲁肽；但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg³⁴-GLP-1^7-37，还需要和N-α-十六酰基-Glu(OSu)-OtBu反应，利用化学方法在Lys²⁶接上侧链；由于Arg³⁴-GLP-1^7-37的侧链均未保护，存在多个活性位点，所以此过程会产生较多杂质，损失较大。

还有报道采用固相化学法制备利拉鲁肽，主要集中在侧链修饰的连接策略上：如专利CN102286092A采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH参与接肽反应，Pd(PPh)₃脱Alloc，然后连接侧链；CN103087181A采用Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH参与接肽反应，用1%TFA/5%TIS/DCM脱侧链保护基，连接侧链；CN103145828A采用Fmoc-Lys(ivDde)-OH参与接肽反应，水合肼脱侧链保护基，然后接侧链反应；CN103980358A采用先液相合成单体Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)-OtBu)-OH,然后参与接肽反应；CN103275209A采用先合成N端保护的利拉鲁肽主链，然后在液相条件下，用N^α-Pal-γ-Glu(OtBu)-OSu与之发生偶联反应，然后经酸TFA脱叔丁基，碱性条件下脱Fmoc或Dde(或ivDde)两步后处理，再经纯化得到利拉鲁肽。