[发明专利]外源基因转化浮萍并进行表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种将外源基因快速高效转化入浮萍并进行表达的方法。

背景技术

浮萍为单子叶水生漂浮植物，为最小的开花植物之一。因其结构简单，增殖快，不仅被广泛应用于植物生理学、遗传学、生态学和环境检测等方面，而且被广泛应用于水体污染的治理。实验室培养的浮萍叶状体从分生细胞处以类似于酵母无性繁殖的营养出芽方式快速增殖，因此遗传非常稳定；浮萍生物量平均每2-3天繁殖1代，生物量增加快，生产周期短；表达产物产量高且容易分离纯化；浮萍可用来生产在细菌和酵母中不易表达的复杂蛋白质，浮萍还可用来表达在哺乳表达系统受限或耗资太高的蛋白；严格的无菌培养使其不易受病毒的感染，其表达的疫苗安全性高；浮萍相对于其他植物来说不需要田地来进行种植生长，可通过采用野外有营养的废水来低廉生产有价值的融合蛋白或肽，而且还能净化废水供再利用；浮萍可在发酵罐或生物反应器中生长，使其更容易整合入现存的蛋白质生产工业基础建设中；因此采用浮萍作为植物生物反应器系统在生产重组蛋白方面具有良好的应用前景。

目前已经有两种浮萍成功开发为商业化生物反应器，分别是美国BIOLEX公司的LEX SystemTM表达系统和法国Lemna Gene公司的Lemna Gene TM SA表达系统，二者价格都很昂贵。国内以浮萍作为表达系统还未见报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种外源基因转化浮萍并进行表达的方法，包括如下步骤：

步骤一：将外源基因转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；然后配制农杆菌重悬液；

步骤二：在所述浮萍叶状体区域割划若干处，然后将所述割划后的浮萍叶状体在所述农杆菌重悬液中浸泡10-15min，通过所述重组农杆菌将所述外源基因生长到所述浮萍叶状体中；然后将所述浮萍叶状体移植入铺有无菌滤纸的共培养基中，室温下避光培养3天以上。

优选地，所述农杆菌重悬液的配制步骤为：挑取重组农杆菌单菌落在YEB固体培养基上活化；活化完成后的重组农杆菌单菌落再接种到YEB液体培养基中，26～30℃生长过夜，获得重组农杆菌菌液；然后按照体积比为1:50～100将所述重组农杆菌菌液接种于含有50mg/L卡那霉素，10mg/L利福平和20mg/L乙酰丁香酮的YEB液体培养基中形成接种液，于26～30℃振摇至使所述接种液在波长为600nm的吸光度值为1.0；最后将所述接种液重悬于含3％蔗糖，20mg/L乙酰丁香酮和0.6M甘露醇的1/2MS液体培养基中，得到农杆菌重悬液。

优选地，所述步骤二还包括对浮萍的预处理：在SH培养基含1％蔗糖和10μM吲哚乙酸中于23℃，在光生物反应器中16h光照/8h黑暗，40μmol/m²·sec预培养2周以上。

优选地，还包括一正交试验，即选用抗生素水溶液，浓度分别为0、5、10、20和40mg/L；每个浓度处理若干组浮萍叶状体，重复若干次；植物激素水溶液，浓度分别各为0、0.5、1、2和5mg/L；每个浓度处理若干组浮萍叶状体，重复若干次，通过分析极差值找出未经过转化的浮萍在抗生素、植物激素影响下的最佳生长条件。

优选地，所述农杆菌重悬液中所述重组农杆菌的浓度为1×10⁸cfu/mL～1×10⁹cfu/mL。

优选地，所述外源基因为pcambia-1300-GFP双元质粒；所述农杆菌为EHA105。

有益效果：

1、本发明选用pcambia-1300-GFP双元质粒作为外源基因的载体重组农杆菌EHA 105，该载体具有插入片段长，转化效率高的特点，能够很方便地将复杂的外源基因整合到载体上；

2、本发明采用pcambia-1300-GFP双元质粒作为外源基因的载体，该载体表达产物为绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下激发后发绿色荧光，可以方便观察阳性转化浮萍株。

3、本发明采用浮萍叶状体直接作为转化受体，不必经过愈伤组织，该方法操作方便，转化效率高，大大简化了将外源基因转化到宿主植株浮萍的操作，转化阳性率大大提高；