[发明专利]一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法

权利要求书

1.一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，待检燕窝制品DNA的提取；

步骤二，金丝燕成分实时荧光PCR扩增；

首先，在PCR反应管中加入2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游 引物各0.5-1μL，Taqman探针0.5-1μL，50ng/μL待检燕窝制品DNA1-2μL， 补充双蒸水至25μL，混匀；

其次，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

a.94-95℃5min，1个循环，预变性；

b.94-95℃10-20sec；60℃20-40sec，40个循环，PCR扩增；

步骤三，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果。

2.根据权利要求1所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征 在于，通过特异性扩增金丝燕的12SrRNA基因序列对燕窝进行鉴定，扩增的 DNA片段大小为144bp。

3.根据权利要求2所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征 在于，步骤二中，扩增金丝燕12SrRNA基因的上游引物、下游引物、TaqMan 探针的序列如下：

上游引物序列:5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’

下游引物序列:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’；

TaqMan探针序列：

5’-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3’，

其中5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法， 其特征在于，步骤二中，对金丝燕成分实时荧光PCR扩增时，应设立三个对 照：阳性对照：金丝燕基因组DNA、阴性对照：非金丝燕基因组DNA、空白 对照：不含DNA模板；

并且，同时扩增真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因。

5.根据权利要求4所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在 于，步骤二中，分别配置真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因的上 游引物、下游引物和Taqman探针。

6.根据权利要求4所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在 于，步骤三，分析扩增结果时，应设置的各种对照实时PCR检测结果应全部符 合以下情况，否则应重做实验：

a.阳性对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都出现扩增 曲线，Ct值小于30；

b.阴性对照的真核生物18SrRNA基因出现扩增曲线，Ct值小于30，金丝 燕12SrRNA基因未出现扩增曲线，Ct值≥40；

c.空白对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都未出现扩 增曲线，Ct值Ct值≥40。

7.根据权利要求4所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在 于，待检燕窝制品的真核生物18SrRNA基因实时PCR检测结果Ct值应小于30， 否则重新提取DNA。