[发明专利]一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及化学检测技术领域，具体涉及燕窝的鉴定方法。

背景技术

燕窝是中国自明代以来开始被食用的传统名贵食品之一，是指雨燕目雨 燕科金丝燕属的几种金丝燕摄食的昆虫、海藻、银鱼等物经消化后，分泌出 来的唾液与绒羽等混合筑成的巢窝。燕巢呈半月形，，直径6～7厘米，基底 厚，廓壁薄，重约5～15克。燕巢外围整齐，内部粗糙，有如丝瓜网络。主 要产自印尼、马来西亚、泰国和越南等东南亚国家。

中医认为燕窝："养阴润燥、益气补中、治虚损、咳痰喘、咯血、久痢”， 适宜于体质虚弱，营养不良，久痢久疟，痰多咳嗽，老年慢性支气管炎、支 气管扩张、肺气肿、肺结核、咯血吐血和胃痛病人食用。研究发现燕窝含有 丰富的活性蛋白质，以及钙、磷、铁等微量元素。其含有的表皮生长因子和 水溶性物质能够刺激细胞分裂、再生和组织重建，促进人体康复。同时能增 强人体免疫力，抵抗病毒和感冒。由于燕窝具有较高的营养和保健价值，市 场对燕窝制品的需求量日益增加。一些商贩以银耳、猪皮、琼脂、果胶等原 料伪造燕窝制品，危害了消费者的利益。

目前燕窝真伪鉴定方法主要是经验鉴别法、显微鉴别法和仪器鉴别法(包 括凝胶电泳法、红外光谱法、气相色谱法等)。这些方法中有的准确性不高， 灵敏度低；有的提取纯化程序冗长，重现性不好；有的鉴别成本高昂。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，解决以 上技术问题。

本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：

一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，待检燕窝制品DNA的提取；

步骤二，金丝燕成分实时荧光PCR扩增；

首先，在PCR反应管中加入2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游 引物各0.5-1μL，Taqman探针0.5-1μL，50ng/μL待检燕窝制品DNA1-2μL， 补充双蒸水至25μL，混匀；

其次，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

a.94-95℃5min，1个循环，预变性；

b.94-95℃10-20sec；60℃20-40sec，40个循环，PCR扩增；

步骤三，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果。

本发明的主要原理是燕窝主要来自金丝燕的唾液，里面含有金丝燕的 DNA，通过检测燕窝中的金丝燕12SrRNA基因来鉴别燕窝的真假。如果燕 窝制品中能检出金丝燕特异性12SrRNA基因，则待检燕窝制品为真燕窝；如 果未检出金丝燕特异性12SrRNA基因，说明待检燕窝制品为假冒燕窝。

本发明特异性好、灵敏度高的特点，简单快速，整个检测过程只需要3～ 4小时。

步骤一中，待检燕窝制品DNA的提取可以采用普通酚-氯仿抽提法或使 用DNA提取试剂盒。

在步骤二与步骤三之间，进行DNA浓度的测定，将DNA浓度调整为50ng/ μL，首先使用紫外分光光度计检测提取待检燕窝制品DNA的吸光值A260 和A280，其A260/A280比值在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：

C＝A*N*50；

其中C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值；

N—DNA稀释倍数；

将DNA浓度稀释到50ng/μL。

步骤二中，通过对金丝燕特异性12SrRNA基因进行扩增。

通过特异性扩增金丝燕的12SrRNA基因序列对燕窝进行鉴定，扩增的 DNA片段大小为144bp。

步骤二中，扩增金丝燕12SrRNA基因的上游引物、下游引物、TaqMan 探针的序列如下：

上游引物序列:5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’

下游引物序列:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’；

TaqMan探针序列：

5’-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3’，

其中5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。