[发明专利]检测人ATP7B基因突变型的方法和试剂盒

权利要求书

1.一种检测基因突变型的试剂盒，该试剂盒包括以下成分：PCR扩增引物、质谱延伸引物和MassARRAY芯片。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下成分：

PCR反应缓冲液；

PCR反应Taq酶；

SAP反应缓冲液；

SAP酶；

延伸反应缓冲液；和/或

延伸反应Taq酶。

3.一种检测ATP7B基因突变型的试剂盒，该试剂盒包括以下成分：

1)PCR扩增引物，所述PCR扩增引物选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:36中的一对或多对；优选地，所述PCR扩增引物包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:36；且更优选地，所述PCR扩增引物由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:36组成；

2)质谱延伸引物，所述质谱延伸引物选自SEQ ID NO:37～SEQ ID NO:54中的一个或多个；优选地，所述质谱延伸引物包括SEQ ID NO:37～SEQ ID NO:54；且更优选地，所述质谱延伸引物由SEQ ID NO:37～SEQ ID NO:54组成；

3)MassARRAY芯片。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下成分：

PCR反应缓冲液；

PCR反应Taq酶；

SAP反应缓冲液；

SAP酶；

延伸反应缓冲液；和/或

延伸反应Taq酶。

5.一种检测基因突变型的方法，所述方法包括：

1)PCR扩增引物的制备：PCR扩增引物为根据所选择的待检测的基因突变型设计的特异性针对每种突变位点的扩增引物，所述PCR扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列；所述PCR扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基，在5'端具有长度为5-15个碱基的标签序列，以区分所述PCR扩增引物与质谱延伸引物；

2)质谱延伸引物的制备：质谱延伸引物的长度为17-28个碱基并且其3'端位于基因突变位点的上一个碱基，质谱延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为基因突变位点；其中，用于质谱检测的质谱延伸引物按照下列原则设计：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da，各质谱延伸引物的野生型延伸产物与突变型延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，质谱延伸引物与延伸产物的分子量在4500-8500Da之间，各延伸产物和各质谱延伸引物之间的分子量差异不小于9Da；

3)检测模板的制备：提取待测样本DNA：

4)以步骤3)中提取的DNA为模板，使用步骤1)中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增产物；

5)SAP酶处理，除去步骤4)获得的扩增产物中含有的未反应的dNTP；

6)以步骤5)中获得的扩增产物为模板，使用步骤2)中的质谱延伸引物通过延伸反应，在质谱延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物；

7)纯化步骤6)中获得的延伸产物；

8)将纯化后的产物采用飞行时间质谱基因分型系统进行检测和分型。