[发明专利]检测人ATP7B基因突变型的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及多重PCR扩增技术和飞行时间质谱基因分型系统(MassArray)领域。更具体而言，本发明涉及一种检测人ATP7B基因突变型的方法和试剂盒。

背景技术

肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration，HLD)又名Wilson病(Wilson’s disease，WD)，是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍疾病，不同人群的发病率约为15～30/100万，其基因定位于13q14.3，cDNA编码一种由1465个氨基酸组成的分子量约165Kda的P型铜转运ATP酶(copper-transporting P-type ATPase,ATP7B)。WD患者由于ATP7B基因突变使位于肝细胞高尔基反面网状结构(trans-Golgi network,TGN)及胆管膜侧的ATP7B酶功能缺陷，引起铜离子跨膜转运障碍，导致铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CP)合成障碍及胆汁中铜的排泄受限，过量的铜不能排泄出体外而在肝、脑、肾、角膜等部位沉积并引起相应的组织脏器损伤，患者可能出现血清CP水平减低、肝硬化、神经/精神症状、角膜K-F环等临床表现。WD是少数可以治疗的神经遗传病之一，患者如果能在发病早期或症状前期被确诊并得到及时治疗，大多预后良好，反之病情逐渐加重甚至危及生命。但由于铜在不同脏器中沉积的速度和程度不同，许多患者早期症状复杂多样，极易被误诊为其他疾病，实验室铜代谢检查等又存在假阳性或假阴性结果，因此本病的早期诊断特别是症状前期和产前诊断较为困难。长期以来，国内外众多学者一直探索采用各种基因诊断技术对WD患者进行症状前期及产前诊断。

在WD基因被克隆之前，Figus等即采用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)-家系连锁分析方法对WD家系成员及先证者进行产前诊断和杂合子的检出。在国内，吴志英、王丽娟等则对位于WD基因内部及其侧翼区的D13S301、D13S316、D13S133和D13S314等短串联重复序列(short tandem repeat,STR)进行连锁分析，证实了该方法的可行性。但这些方法所用的DNA遗传标记与WD基因距离较远，重组率高，且必须与同一家系的先证者进行比较，因此不能对无WD家族史或家系中先证者已死亡的可疑WD患者进行诊断。2007年，Gupta等选择了4个WD基因的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)位点对印度人WD家系进行检测，在17个WD家系的28例患者中有25例与上述SNP位点的单倍体型有相关性，其阳性率接近90％。作为第3代分子遗传标记，SNP具有遗传稳定、重组率低等优点。有学者建议其与RLFP及其他方法结合起来，可大大提高有先证者的WD患者的基因诊断效率。

随着WD基因的克隆，通过各种基因诊断技术检测ATP7B基因的突变对本病患者进行症状前期及产前诊断成为可能。1995年，Thomas等采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)分析结合DNA测序技术率先对WD患者进行ATP7B基因突变的研究，在58例欧洲裔WD患者中共发现了25种突变类型，其中第14外显子His1069G1n和第18外显子Gly1266Lys有较高的突变频率。此后多项研究证实14外显子和18外显子是欧美人WD患者的高频突变热区。国内多家单位利用该方法对中国人WD基因突变进行研究，积累了丰富的研究资料。但该方法不能明确突变部位和性质，且易出现假阳性或假阴性结果，目前多用于突变的筛选，其最终结果需经DNA测序来证实。

上世纪90年代末出现的变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)分析技术由于具有快速、敏感、准确且经济的特点，也被用于WD的基因诊断。Vrabelova等应用该技术结合RLFP和DNA测序等技术对227例东欧人WD患者进行检测，总共发现40种突变和18种多态，检出率达80.3％。国内杨静芳等采用该方法对74例中国WD患者进行了检测，共发现22种突变和11种多态，经DNA测序证实其符合率为100％。但该方法与SSCP同样不能明确突变部位和性质，故仅适用于大样本筛查已知或未知突变。