[发明专利]尼古丁降解菌Pseudomonas sp.MHJY8及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8及其筛选方法和应用。

背景技术

尼古丁(Nicotine)，又称烟碱，是重要的生物碱之一，主要存在于茄科植物中，烟草的尼古丁含量占其总植物碱含量的95％以上，是影响烟草品质的关键性指标之一。通过主动或被动吸烟摄入人体内的尼古丁产生的危害广泛而深刻，不提倡甚至禁止吸烟已经成为全世界的共识。随着人们对健康关注度的不断提高和我国禁烟令适用范围的不断扩大，如何有效控制和降低烟叶中的尼古丁含量，是烟草种植农户和卷烟生产企业无法规避的重要问题，有关方面的研究必将再次成为一个热点。

大量的文献报道表明，实现对烟草中尼古丁含量的精确控制是极为困难的。结合烟草种植和卷烟生产工艺特点和现状，通过生物降解的方法仍然是最为可行的策略，国外很早就开始了运用微生物降解尼古丁的研究与实践，并取得了一定的成效。截至目前，通过微生物降解尼古丁的实践普遍存在的问题是：高效降解尼古丁的野生菌株遗传资源匮乏，株型相对单一；大部分菌种活性偏低，实际开发利用潜力不足；很多具有尼古丁降解能力菌株的生理特性不能很好的与烟草栽植现状和卷烟生产工艺相衔接；高活性的尼古丁降解专利菌株偏少，理论研究与实际应用衔接不够。

资料显示，尼古丁降解效率最高的菌株主要存在于节杆菌属Arthrobacter和假单胞菌属Pseudomonas中，隶属于其它分类单元的菌种资源活性普遍偏低，难以到达实用效果。本发明通过大量的实验实践，筛选出一株具有高效降解尼古丁能力的菌株，进一步丰富了降解尼古丁野生菌株遗传资源，存在较大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的之一是为解决尼古丁降解菌种较少，降解效率低等难题，提供一种尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8及其筛选方法和应用。

本发明提供一种尼古丁降解菌，所述尼古丁降解菌为尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8，保藏时间为2015年1月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCCNO：M2015072。尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8序列如SEQIDNO：1所示。

本发明还提供一种上述尼古丁降解菌Pseudomonassp.MHJY8在降解尼古丁中的应用。

本发明再提供一种尼古丁降解菌的筛选方法，包括以下步骤，

尼古丁降解菌初筛：称取土壤样品5g，无菌操作加入装有45ml生理盐水和玻璃珠的250ml锥形瓶中，震荡30min，使样品中的菌体均匀分散，静置30s使其自然沉淀，取上层菌悬液进行10倍系列梯度稀释至10^-6，取0.1ml稀释度为10^-3～10^-6的稀释液分别涂布于尼古丁降解菌初筛培养基，于30℃倒置培养48h；

尼古丁降解菌初筛菌株划线纯化：用接种环从上述尼古丁降解菌初筛培养基中挑取生长良好、特征典型的单菌落，在同一所述尼古丁降解菌初筛培养基上进行划线纯化，连续进行3次，将纯化菌株接种于LB斜面培养基上，4℃保藏。

进一步的，所述尼古丁降解菌初筛培养基为取酵母提取物2g，山药4g(市售新鲜山药，去皮，研碎)，K₂HPO₄13g，KH₂PO₄4g，(NH₄)₂SO₄0.2g，NaCl5g，琼脂粉20g，微量元素混合液10ml，蒸馏水定容至1000ml，自然pH，培养基121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却至50℃时，无菌操作条件下用0.22μm滤膜规格的针头过滤器加入尼古丁1g，混匀，即得。

进一步的，所述微量元素混合液为取MgSO₄·7H₂O1g，MnSO₄·H₂O0.4g，CuCl₂·2H₂O0.2g，CaCl₂·2H₂O0.2g，FeSO₄·7H₂O0.02g全部溶解于70ml0.1mol/LHCl溶液中，蔬菜汁(市售V8蔬菜汁)定容至100ml，即得。

进一步的，所述尼古丁降解菌液体培养基为不加琼脂的尼古丁降解菌初筛培养基。