[发明专利]一种镇痛活性多肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种具有镇痛活性多肽的制备方法，属于基因工程领域。

背景技术

在长期进化中，植物发展出不同的防卫系统抵御植物病原微生物，通常是产生小分子物质抑制微生物的生长。

近年来，已发现硫堇（thionin）、防御素（defensin）、几丁质酶（chitinase）、抗菌肽等在植物防御病原微生物中发挥着重要作用。抗菌肽PaAMP是Liu等人从美洲商陆（Phytolacca americana）的种子中分离纯化出来的抗菌肽（Liu Y, Luo J, Xu C, Ren F, Peng C, Wu G, and Zhao J. Purification, characterization, and molecular cloning of the gene of a seed-specific antimicrobial protein from pokeweed. Plant Physiology. 2000, 122: 1015-1024），其表达具有种子特异性。在萌发过程中，植物种子也会受到病原微生物或非病原微生物的侵袭，抗菌肽PaAMP1在种子萌发过程中被合成后分泌到周围环境，对抑制这些微生物的生长具有重要作用。PaAMP1成熟肽全长38个氨基酸残基，富含半胱氨酸，多达6个半胱氨酸，其二硫键骨架与具镇痛活性的芋螺毒素ω-MⅦA完全一致。但是，抗菌肽PaAMP1是否具有镇痛活性，在国内外尚无相关报道。利用凝胶过滤层析等技术从美洲商陆种子种分离纯化PaAMP，但含量低，获得的PaAMP数量有限，不利于对PaAMP做深入的功能研究。基因工程手段是获得大量重组目的蛋白的快速、有效的方法。在大肠杆菌表达系统中，pET-32a载体上的Trx蛋白有利于二硫键的形成，而经遗传改造的大肠杆菌Origami（DE3）菌株的细胞内为氧化状态，也有助于二硫键的形成。

因此，本发明借助基因工程手段，在大肠杆菌pET-32a/Origami（DE3）表达系统中，实现了具三对二硫键的抗菌肽PaAMP1的高效表达，并首次证实基因工程菌表达的重组PaAMP1具有镇痛活性，为PaAMP1作为镇痛药物的应用提供了依据。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中对PaAMP功能研究的不足而公开一种具镇痛活性的多肽的制备方法及其应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

（1）根据大肠杆菌密码子使用频率优化植物抗菌肽PaAMP1基因的密码子；

（2）化学合成优化后的PaAMP1基因，经BamHI/HindIII双酶切后，连入经同样酶切的原核表

达载体pET-32a，得到重组质粒pET-32a-PaAMP1，将重组质粒导入大肠杆菌Origami（DE3）菌株感受态细胞，得到基因工程菌Origami-PaAMP1；

（3）将Origami-PaAMP1菌株接种于含氨苄青霉素的LB培养基震荡培养，经IPTG诱导后高效表达产生可溶性重组PaAMP1；

（4）用镍离子亲和层析纯化后获得重组PaAMP1，采用小鼠醋酸扭体法证实，重组

PaAMP1具有显著的镇痛活性。

从美洲商陆种子中提取的天然抗菌肽PaAMP1，除了三对二硫键之外，没有其他复杂的修饰，由于重组PaAMP1具有镇痛活性，因此，易推测从天然产物中分离纯化或用化学方法合成的PaAMP1也具有镇痛活性。

除了PaAMP1，美洲商陆中还有另一个序列与之高度一致的抗菌肽PaAMP2；生物信息学分析表明，紫茉莉（Mirabilis jalapa）、冰叶日中花（Mesembryanthemum crystallinum）等植物中也具有MjAMP1、MjAMP2、McAMP等抗菌肽，这些抗菌肽的氨基酸序列与美洲商陆PaAMP1高度相似，因此，易推测美洲商陆的PaAMP2和其他植物来源的抗菌肽MjAMP1、MjAMP2、McAMP等也具有镇痛活性。由于美洲商陆、紫茉莉、冰叶日中花等植物易于大规模种植，因此有望从这些植物中工业化提取镇痛多肽，满足镇痛药物的研发及临床需求。

本发明的有益效果：