[发明专利]一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其特征在于，来自于癌症患者自身的单个核细胞，在使用3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞作为滋养层细胞和白介素2作用下扩增激活获得自然杀伤细胞，使自然杀伤细胞得以大量增殖；培养至21天细胞增殖倍数达到2500倍以上，NK细胞数达到3×10⁹以上；CD16+/CD56+表型为90％以上；所述自然杀伤细胞具有抗肿瘤杀伤毒性；

所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞与来源于患者自体外周血的单个核细胞首先共培养5天，所述K562细胞与淋巴细胞的用量比例为K562细胞数∶淋巴细胞数＝1∶0.1-1∶10；共培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充10-20mL新鲜细胞培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中继续培养2-3天；继续补充20-40mL新鲜细胞培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到18-21天，使得NK细胞大量增殖；所述新鲜细胞培养基含50-2000活性单位/mL白介素2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中以K562细胞系转染稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因，可以得到在K562细胞膜上的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122多肽，K562细胞经培养增殖后仍稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122；经培养后的K562细胞膜上具有表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的细胞，通过强酸、 强碱和/或辐照， 及通过高速离心收集K562细胞进行纯化收集。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得自然杀伤细胞，增殖倍数达2500倍以上，培养到21天自然杀伤细胞数达3×10⁹以上。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中培养获得自然杀伤细胞，高表达其特异标志物CD16+/CD56+，阳性率高于90％，而CD3+阳性率低于7％。

5.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中培养获得自然杀伤细胞，体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。

6.一种制备自体自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)经强酸、 强碱和/或辐照处理的权利要求1-5中任一项所述的稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞；

(2)白介素2；

(3)淋巴细胞培养基；

(4)组织消化液；

(5)淋巴细胞分离液；

(6)生理盐水；

(7)使用说明书；

其中，所述使用说明书包括权利要求1-5中任一项所述的方法。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞，优选地，还包括强酸、 强碱和/或辐照处理后含稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562滋养层细胞的培养板，所述培养板选自24孔细胞培养板、12孔细胞培养板或6孔细胞培养板。