[发明专利]一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其中包括如下特征：来自于癌症患者外周血来源分离得到的单个核细胞，在使用3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2作用下扩增激活，获得自然杀伤细胞；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞的试剂盒，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural Killer cells，NK)数量和功能异常与肿瘤和持续性病毒感染的发生密切相关。目前NK细胞在体外加白介素2(interleukin-2，IL-2)培养扩增后，其抗肿瘤作用比LAK细胞强50-100倍，而且只需要小量的IL-2就可以发挥作用，并且因其对自身肿瘤靶细胞具有特异性，成为国内外肿瘤生物研究的热点，并在临床治疗中得到使用。

NK细胞主要表达CD16⁺、CD56⁺表型，治疗对黑色素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等肿瘤治疗有明显疗效。NK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量NK细胞有限和培养时间过长。NK细胞体外扩增至5×10⁸平均需59天，扩增至5×10⁹则平均需80天，NK在含IL-2的培养基中经过一段时间培养后出现选择性扩增T淋巴细胞，CD3⁺占80％以上，CD4⁺和CD8⁺占50％以上，NK细胞扩增低下，占不到10％左右。因而传统使用的小剂量白介素2激活生长倍数有限，端粒酶活性降低，培养时间过长引起了NK细胞杀伤功能低下。

本发明提供了以3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞为滋养层细胞，在小剂量IL-2作用下大量扩增NK细胞，培养至21天细胞增殖倍数达到2500倍以上，NK细胞杀瘤活性在21天达到最佳，为患者临床治疗大大节约了时间，并发挥出最好的抗肿瘤作用，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且可以大大降低细胞培养成本。

发明内容

本发明针对现有技术增殖培养NK细胞的不足，特别是因NK细胞扩增到临床治疗需要的细胞数量而培养时间过长，含IL-2的培养基选择性扩增T淋巴细胞以及NK细胞占有比例很低，因而产生的杀瘤活性低下。本发明通过前期研究实验发现转染了3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3′-phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)和CD122并稳定表达的K562细胞，作为滋养层细胞和低剂量IL-2作用下培养NK细胞，培养至21天细胞增殖倍数达到2500倍以上，NK细胞数达到3×10⁹以上足以满足临床抗肿瘤的作用，保证癌症患者临床治疗疗效。

K562细胞转染了3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的表达载体，细胞膜上可稳定表达PDK1和CD122的多肽。PDK1为AGC蛋白激酶家族的主要调节器，研究发现PDK1是NK细胞早期发育关键分子，激活了白介素15表达升高，也活化了CD122分子表达提高，使得NK细胞能够在不受外界“致敏”的情况下自发杀死机体中异常的细胞。因而应用3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞可以作为人工抗原递呈细胞，可以促进NK细胞发育和大量增殖，抑制NK细胞中T淋巴细胞的增殖和产生，延长NK细胞端粒酶活性，可产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。

本发明涉及一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其特征在于，使用PDK1和CD122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2，扩增激活自然杀伤细胞，使自然杀伤细胞得以大量增殖。

本发明所述的K562细胞系转染稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因，可以得到在K562细胞膜上的PDK1和CD122多肽，K562细胞经培养增殖后仍稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122。经培养后的K562细胞膜上具有表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的细胞，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞进行纯化收集。

本发明所述方法中单个核细胞来源于癌症患者采集的外周血或骨髓等，经淋巴细胞分离液，连续密度梯度离心获得的。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。