[发明专利]一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于林学中树木内源激素技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法(HPLC)测定茶树顶芽内源激素含量的方法。

背景技术

茶树(Camellia sinensis)在我国栽种历史悠久，是我国南方传统的经济植物(张玉翠，2010)。目前关于茶树的科学研究，多集中在形态指标、光合特性及内在品质等方面。通过分子机理的研究，深入认识植物激素调控茶树生长、发育及其对环境适应的机制，具有重要的科学意义。

植物激素(plant hormone,PH)是指在植物体的某一部位合成，可转移到其他部位，并对植物的生长发育具有显著调节作用的微量有机物，亦称植物天然激素或内源激素。植物内源激素种类多，含量甚微，且易被破坏。它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发、植物形态建成以及离体组织培养等方面具有重要作用(Santner A，2009)。茶树作为我国重要的农业经济作物，以采摘幼嫩新梢为主。茶芽的萌发及生长极易受外界环境的影响，这些影响在很大程度上都是通过植物激素直接进行作用的(岳川，2012)。

由于吲哚乙酸和赤霉素都可以与化学试剂反应，生成物在紫外光激发下可以呈现出不同颜色的荧光，因此可用荧光法测定其含量，植物激素的测定还有纸层析、气相色谱(GC)、等方法，但由于分离效率和灵敏度的局限，目前关于植物顶芽和叶片的内源激素测定方法主要为间接酶联免疫吸附法(ELISA)，已有茶树顶芽内源激素测定方法是间接酶联免疫吸附法(ELISA)，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。但需要购买酶联免疫试剂盒，对试验条件高。

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC)是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，因其高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，广泛用于各个领域，也是目前用于茶树内源激素测定的重要方法。高效液相色谱法测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，但对配制流动相、设置色谱条件要求较高；由于茶树嫩芽中存在茶多酚等多酚类物质生化成分，会对激素的测定造成干扰，因此其样品的前处理与其他品种样品前处理存在差异。目前关于利用高效液相色谱法测定茶树顶芽的内源激素的方法前人研究较少，尚未有相适宜的测定方法研究成果。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种用于HPLC法测定茶树顶芽的内源激素的方法，具有高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点。本发明主要解决了在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤：

1)样品收集冷冻与预处理；

2)配置流动相及设置色谱条件；

3)配置标准溶液并建立回归方程；

4)样品待测溶液检测；

所述流动相由甲醇与0.075％冰乙酸溶液组成；所述标准溶液包括IAA标准液、ZT标准液、ABA标准液和GA₃标准液。

进一步的，在本发明中，步骤2)所述色谱条件为流速0.7mL/min，检测波长210nm和254nm，柱温25℃，进样量20μL。

进一步的，在本发明中，步骤2)所述流动相的配置方法为：再将甲醇与0.075％冰乙酸溶液分别进行抽滤及超声波震动30min，按体积比为45:55配制流动相。

进一步的，在本发明中，步骤3)所述标准溶液包括0.1g/L的IAA标准液、0.001g/L的ZT标准液、0.001g/L的ABA标准液和0.01g/L的GA₃标准液。

进一步的，在本发明中，步骤1)所述样品收集冷冻的具体方法为：采集茶树嫩芽样品，置于液氮中5min后放入冰箱冷冻保存。

进一步的，在本发明中，步骤1)所述样品预处理的具体方法为：

1-1)浸提：称取冷冻的茶树嫩芽样品，加入80％冷甲醇研磨，置于4℃下静置16h后，抽滤得粗提液；

1-2)一次萃取：将步骤1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，弃去醚相，保留水相；

1-3)旋转蒸发：将步骤1-2)所得水相在37℃下旋转蒸发至溶液体积的1/4至1/5；