[发明专利]一种转基因西瓜植株的制备方法

权利要求书

1.一种转基因西瓜植株的制备方法，包括以下步骤：

(1)含外源目的基因的农杆菌菌液侵染西瓜成熟子叶外植体；所述西瓜成熟子叶外植体获得方法为：取健康饱满的西瓜种子，剥去种皮，避免伤及种仁，用70％乙醇溶液消毒30sec，无菌水清洗；有效氯浓度为0.2％-0.3％的次氯酸钠溶液消毒10-15min，无菌水清洗后接入BM培养基，28℃暗培养3天，切取健康萌动的种仁，自子叶近轴端，1.5mm×1.5mm切片，及时接入MS液体培养基中；侵染方法为将OD600为0.8-1.0的含外源基因的农杆菌菌液与西瓜成熟子叶外植体混匀，侵染10min；

(2)侵染后，将外植体转入共培养基中，在28℃黑暗条件下培养4天，所述共培养基为三层无菌滤纸，加入液体共培养基浸透滤纸；外植体置于滤纸之上共培养；所述液体共培养基的配方为1650mg/L NH₄NO₃，1900mg/L KNO₃，170mg/L KH₂P0₄，370mg/L MgSO_4.7H₂O，332mg/L CaCl₂，223mg/L MnSO₄.4H₂O，6.2mg/L H₃BO₃，8.6mg/L ZnSO₄.7H₂O，0.83mg/L KI，0.025mg/L Na₂MoO₄.2H₂O，0.025mg/L CuSO₄.5H₂O，0.025mg/L CoCl₂.6H₂O，27.8mg/L FeSO₄.7H₂O 37.3mg/L EDTA.Na₂，1000mg/L肌醇，5mg/L烟酸，5mg/LVB₁，0.5mg/L VB₆，1.5mg/L6-BA，30g/L蔗糖，pH5.8，高压灭菌；

(3)共培养结束后，将步骤(2)的外植体转移到含低浓度筛选剂的筛选培养基上进行筛选培养，之后逐渐提高筛选剂的浓度进行筛选培养，挑选抗性外植体；具体方法为：共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入含3-3.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，筛选培养2-3周后，将抗性外植体转入含4.5-5.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，继续筛选培养2-3周，当抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将不定芽切下转入含6.5-7.5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基继续培养2-3周；

(4)将抗性外植体幼芽转入芽伸长培养基继续筛选2-3周，每周继代一次，将不定芽基部残留外植体和瘤状愈伤逐渐切除，使芽与培养基充分接触，取生长良好的完整幼苗，转入生根培养基，幼苗生根后炼苗、移栽，得到转基因西瓜植株。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)三层滤纸作为共培养基质且加入液体共培养基的量应同时满足以下条件，即刚好浸润滤纸且无多余液体流出并保证28℃共培养4天后滤纸不干涸。

3.如权利要求1-2任一所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法为，共培养结束后，选择正常膨大的黄色子叶切片外植体直接转入含3mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，筛选培养2周后，将抗性外植体转入含5mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基，继续筛选培养2周，当抗性外植体在切口边缘有绿色瘤状愈伤生成并分化出不定芽时，将不定芽切下转入含7mg/L草铵膦和300mg/L羧苄青霉素的筛选培养基继续培养2周。

4.权利要求1-3任一所述的制备方法在西瓜遗传改良及育种中的应用。