[发明专利]一种转基因西瓜植株的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，具体地，涉及一种转化率高的转基因西瓜植株的制备方法。

背景技术

从1983年转基因植物诞生以来，植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，导入到目的植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。农杆菌介导的转基因方法是一种天然的植物遗传转化系统，具有易操作、低费用、高效率、外源基因在转基因植物中的拷贝数低和遗传稳定等独特优点，已成为转基因策略中的首选方法，在植物的遗传转化中广泛应用。

西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)为葫芦科一年生草本，是世界性重要瓜类蔬菜作物。1994年韩国学者Choi等首次报道，利用农杆菌LBA4404,将卡那霉素(Kanamycin)抗性基因和GUS标记基因转入了2个西瓜品种。随后，许多研究者对西瓜遗传转化进行了深入研究，将抗病、抗逆、耐贮藏等外源基因导入西瓜，并取得了相应进展。但是西瓜仍然被认为是很难利用农杆菌介导的转基因技术取得成功转化的物种，且转化效率普遍偏低。牛胜鸟等(2005)利用西瓜成熟胚子叶将小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)复制酶基因、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)复制酶基因导入西瓜，转化效率为0.17％；Cho等(2008)报道成功转入bar、nptII基因，转化效率为0.33～1.16％；Huang等(Huang YC，Chiang CH，Li CH.Transgenic watermelon lines expressing the nucleocapsid gene of watermelon silver mottle virus and the role of thiamine in reducing hyperhydricity in regenerated shootsPlant Cell Tiss Organ Cult,2011,106:21–29)报道转移西瓜银斑病外鞘蛋白基因的转化效率为0.9～1.9％；Yu等(Yu TA，Chiang CH，Wu HW，et al.Generation of transgenic watermelon resistant to Zucchini yellow mosaic virus and Papaya ringspot virus type W.Plant Cell Rep,2011.30:359-371)报道将小西葫芦黄化花叶病毒外鞘蛋白基因和番木瓜环斑病毒外鞘蛋白基因转入西瓜，种子转化效率为8.5～10％，(由此推算出其外植体切块转化效率约为1.06％～1.25％)。从已有的报道来看，不同研究者报道结论差异较大，且普遍转基因频率低下。因此农杆菌介导法转化技术在西瓜上的规模化应用目前还存在困难，现有技术不能满足开展西瓜功能基因研究及遗传改良的需要。

目前西瓜全基因组测序及骨干育种材料的重测序工作已经完成，大量功能基因有待验证，在此基础上，将全面带动西瓜分子育种工作的快速发展。这个形势下，对建立一个高效的西瓜转基因技术提出了迫切需求。西瓜是公认的较难转化的作物之一，制约西瓜遗传转化效率的因素主要是在西瓜转基因过程中，普遍存在共培养结束后因农杆菌过度生长导致外植体生长不良；转化细胞与再生细胞重叠性低；逃逸体形成频率高，转化芽频率低；再生株易玻璃化，生根困难等问题。这些问题是导致西瓜外植体转基因植株生产率低的重要原因，而在多数前人的研究工作中都没有引起足够重视，仅把主要研究点放在了激素种类及浓度的配比使用上，取得的进展依然有限，这需要从其他方面改进技术，以建立高效稳定的转基因西瓜的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转化率高、转基因植株生长健壮、存活率高的转基因西瓜植株的制备方法。

本发明提供的一种转基因西瓜植株的制备方法，包括以下步骤：

(1)含外源目的基因的农杆菌菌液侵染西瓜成熟子叶外植体；

(2)侵染后，将外植体转入共培养基中培养，所述共培养基为三层无菌滤纸，加入液体共培养基浸透滤纸；外植体置于滤纸之上共培养；

(3)共培养结束后，将步骤(2)的外植体转移到含低浓度筛选剂的筛选培养基上进行筛选培养，之后逐渐提高筛选剂的浓度进行筛选培养，挑选抗性外植体；