[发明专利]基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法

权利要求书

1.一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)首先对野生型柚和突变型柚的果皮、果肉各个组织进行深度30X的DNA重测序，并对得到的数据进行质量检测，去除其中低质量的部分，得到各组材料高质量的测序reads；

2)然后以已发布的甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因组上；再使用samtools/GATK进行SNP calling和genotyping，得到各组材料的多态性位点；

3)根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAL、DP和MQ属性赋权值，从而计算出各组材料各个SNP位点的Q值；并综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型柚和突变型柚中的SNP的Q值进行对应比较，

4)采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行校正，找到野生型柚和突变型柚中Q值显著不同即可靠的SNP位点；对上述找到的SNP位点，对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的候选位点；对找到的候选SNP位点进行注释，并推测性状相关变异发生的染色体区域；

5)最后利用Sanger测序方法对候选位点进行实验验证。

2.根据权利要求1所述基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：所述方法还用于果树芽变位点的挖掘和鉴定。

3.根据权利要求1所述基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：所述方法还用于木本植物体细胞突变位点的挖掘和鉴定。

4.根据权利要求1所述基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)制备琯溪蜜柚红肉突变体的基因组DNA

在本实施例中，采用改良的CTAB法提取琯溪蜜柚野生型及其红肉突变体的四个组织的基因组DNA，其四个组织分别为外果皮、中果皮、囊衣和汁胞；

2)基因组测序

a.DNA测序文库的构建：基因组DNA的片段化、末端补平、磁珠纯化；加A即添加dAMP到双链DNA文库片段的3’端、加接头即连接带有3’-dTMP端的双链DNA接头到文库片段；磁珠纯化，切胶回收500bp左右大小的DNA片段；文库扩增；磁珠纯化；

b.DNA文库的测序

对建好的DNA文库用Qubit 2.0测定质量浓度，用Agilent 2100生物分析仪检测插入片段大小，用QPCR测定摩尔浓度，当质量浓度≥2nM、插入片段集中且符合目的大小即可判定文库合格，根据所需30X的数据量对各个文库取样，用hiseq2000-PE125的测序策略上机测序；

3)SNP分析

对测序得到的野生型柚和突变型柚的各个组织数据进行质量检测，并用Trimmomatic-0.30去除其中低质量的部分，得到各组材料高质量的测序reads；以甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因组上；使用samtools/GATK进行SNP calling和genotyping的流程，得到各组材料全基因组范围内的SNP多态性位点；

4)突变位点挖掘

根据检测到的所有的SNP的信息，使用熵权法对SNP的QUAL、DP和MQ属性赋权值，从而计算出各组材料各个SNP位点的Q值，用以综合衡量该处SNP的可靠性；将野生型柚和突变型柚中的SNP的Q值进行对应比较，采用wilcoxon秩检验，并用BH法对p值进行校正，找到野生型柚和突变型柚中Q值显著不同，即可靠的SNP位点；对上述找到的SNP位点，用beagle软件对野生型柚和突变型柚设计case-control型的关联分析，得到突变相关的5个候选位点；

5)相关突变位点的验证

根据5个候选SNP位点所在的序列设计特异性引物，以不同的基因组DNA为模板，用PCR反应体系进行扩增，对所获得的扩增产物直接测序，比较各个体的PCR产物序列，验证该目的序列，最终确定统计水平最显著的候选位点即5号染色体上的SNP位点为突变位点。