[发明专利]基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法

说明书

技术领域

本发明涉及柑橘基因组学及分子育种领域，具体地指一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法。

背景技术

体细胞突变(somatic mutation)是指植物在体细胞水平(如芽的分生组织)发生的突变。芽变是体细胞突变的一种，一般表现在枝、叶、花、果及物候期、成熟期等特征和特性上。人们通过芽变选种选育了很多优良的品种，柑橘主要栽培品种70％以上来自于体细胞变异，如脐橙、温州蜜柑、葡萄柚、克里曼丁橘的一系列品系。选择突变芽及其成长的枝，经过无性繁殖可以创造出新品种称芽变选种。芽变选种作为柑橘育种的一种方式，与其它育种方式(实生选种、杂交育种、辐射诱变育种、原生质体融合育种、转基因育种等)相比，有着独特的优势：其变异性状在田间容易被发现；可通过嫁接繁殖被保存下来；没有童期的干扰；可较快地进行鉴定和推广应用。由于芽变的经常发生以及变异的多样性，使得芽变成为无性繁殖植物变异选择的丰富源泉。随着分子生物学研究手段的迅速发展，人们在对芽变品种进行利用的同时开始研究芽变性状形成的分子机理，以期深入认识芽变的规律，利用基因工程手段定向改良柑橘品种。

目前对体细胞突变机理的研究特别是突变基因的挖掘和鉴定还缺乏有效的方法，特别是利用遗传学手段鉴定突变位点，所需要的时间长(果树一般需要5-10年才能获得杂交后代的果实)，另果树树体大，种植大规模群体的占地面积比较大。以500棵单株的柑橘群体为例，需要10亩地才能定值。因此，无论是正向遗传学(遗传群体定位策略)和反向遗传学(人工突变体库)方法鉴定突变位点在果树上都比较困难，在人力、物力和时间上都很难实现，获得成功的例子仅有少数几例。

通过全基因组序列信息挖掘为鉴定体细胞突变位点提供了一条快速、有效和低成本的途径。特别是二代测序的成本进一步下降(当前市场价降低到250元/Gbase)，通过全基因组测序的策略挖掘芽变位点的成本可以为单个课题组承担。但目前基于基因组测序挖掘体细胞突变位点还缺乏适合的方法(果树基因组具有杂合态等特点)，需要对序列信息分析流程和方法进行优化和改良。全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)。提取全基因组中所有的多态性位点，结合质量值、深度、重复性等因素做进一步的过滤筛选，得到可信度高的SNP数据集，有望在全基因组水平上扫描并检测与重要性状相关的基因序列差异，实现突变位点及重要性状候选基因的筛选。

单核苷酸多态性(SNP)，主要是指近缘种群或同种个体在基因组水平上由于单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异常由单个碱基的转换(transition)或者颠换(transversion)所引起，组成DNA的碱基虽然只有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记即二等位基因(biallelic)。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度。SNP被认为是继RFLP和SSR之后最有前途的第三代分子标记，在植物领域的遗传图谱构建、性状相关分子标记开发、以及生物学基础研究正在快速应用。

PCR扩增目的序列及对其产物进行测序是鉴别SNP的最简捷的方法。根据目的序列设计特异性引物，以不同个体的基因组DNA为模板，用同一PCR反应体系进行扩增，对所获得的扩增产物直接测序，仔细核对各个体的PCR产物序列就可查明该目的序列在所测各个体基因组之间是否存在SNP。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法。本发明可以揭示柑橘芽变品种的突变位点，为解析柑橘体细胞突变机制提供强有力的基因组工具。

为解决上述目的，本发明提供的一种基于基因组测序的体细胞突变位点挖掘方法，包括以下步骤：

1)首先对野生型柚和突变型柚的果皮、果肉各个组织进行深度30X的DNA重测序，并对得到的数据进行质量检测，去除其中低质量的部分，得到各组材料高质量的测序reads；

2)然后以已发布的甜橙基因组为参考基因组，使用软件BWA将各组reads比对到基因组上；再使用samtools/GATK进行SNP calling和genotyping，得到各组材料的多态性位点；