[发明专利]一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白，其特征在于，利用pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。

2.根据权利要求1所述的AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白，其特征在于，所述pGEX-6p-1线性化载体是利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；

上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；

下游引物：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’。

3.根据权利要求1所述的AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白，其特征在于，所述AGV2病毒VP3基因片段是利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因片段；

上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3’；

下游引物：5’-GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3’。

4.一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；

上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；

下游引物：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’；。

2)利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因；

上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3’；

下游引物：5’-GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3’；

3)利用重组酶ExnaseTMII对步骤1)和2)得到的PCR产物在体外进行快速重组克隆VP3，阳性克隆经IPTG诱导表达，实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：

40μl水，5μl10倍缓冲液，1μl10mMdNTP，1μl10μmol上游引物，1μl10μmol下游引物,1μl10ng/μl的pGEX-6p-1质粒或pcAGV2-VP1-3质粒，1μl商品化的PhantaSuper-FidelityDNA聚合酶。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，PCR扩增反应循环参数为：95℃变性3分钟,随后进行30个循环，所述循环为95℃变性10秒,57℃退火30秒，72℃延伸3分钟；最后72℃延伸10分钟。