[发明专利]一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可溶性蛋白，具体涉及一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其制备方法。

背景技术

鸡的传染性贫血病毒(CAV)一直被认为是环形病毒属中唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个新型人源环形病毒HGyV序列。序列分析惊人发现，HGyV与AGV2的基因组序列同源性高达96％。最近，Maggi以及Biagini等人在健康人，器官移植病人以及HIV阳性病人血清样品中也检测到HGyV/AGV2的DNA序列。在国内，叶建强等检测并首次报道了活禽市场鸡群及人血样中AGV2的存在。这些表明AGV2具有潜在的公共卫生意义。然而目前所有的国内外对AGV2的检测均依赖于对AGV2的病毒基因组DNA的PCR扩增，目前尚无检测AGV2蛋白抗原及其抗体的血清学方法。对该病毒的组织嗜性、病毒蛋白表达及感染宿主中AGV2抗体水平等尚无报道。

因此，对AGV2病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现可溶性表达，将为深入开展AGV2抗原及其抗体检测、血清学调查，明确AGV2在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究VP3生物学功能具有重要意义。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种AGV2型环形病毒VP3蛋白及其制备方法。

本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。

实现本发明的技术方案是：

一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白，利用pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。

进一步，所述pGEX-6p-1线性化载体是利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；

上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；

下游引物：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’。

进一步，所述AGV2病毒VP3基因片段是利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因片段；

上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3’；

下游引物：5’-GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3’。

本发明还提供了上述AGV2型环形病毒VP3蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；

上游引物：5’-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3’；

下游引物：5’-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3’；。

2)利用下述引物，以pcAGV2-VP1-3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因；

上游引物：5’-GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3’；

下游引物：5’-GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3’。

3)利用重组酶ExnaseTMII对步骤1)和2)得到的PCR产物在体外进行快速重组克隆VP3，阳性克隆经IPTG诱导表达，实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。

本发明所述的AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白可作为AGV2诊断抗原；以及作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体。