[发明专利]一种用珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

安丝菌素(Ansamitocin)是从放线菌如珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产生的高细胞毒性的化合物。安丝菌素的作用机理是抑制微管蛋白的组装，从而抑制细胞分裂。安丝菌素的细胞毒性非常强，是传统化疗药物长春花碱、甲氨蝶呤和柔红霉素的100-1000倍。

安丝菌素属于大环内酯类化合物，其结构与美登醇相似。珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素主要包括6种同系物，包括P-1、P-2、P-3、P-3’、P-4和P-4’，其中P-3为其主要产物，安丝菌素同系物的结构如下式所示。

安丝菌素具有高效的抗B-16黑色素瘤、恶性毒瘤180及P185肥大细胞瘤等活性。经过化学转变能合成含硫醇的美登素，虽然美登素类化合物因其极强的细胞毒性而在肿瘤治疗领域受到关注，但是在美国的II期临床研究表明其具有剂量限制毒性而被排除临床应用，然而美登素可作为合成抗体偶联药物的“弹头”，具有令人满意的疗效和较低的毒副作用，例如，罗氏公司的以DM1作为药物“弹头”的trastuzumab emtansine(T-DM1，Kadcyla^TM)已经于2013年2月22日被美国PDA批准上市，用于治疗乳腺癌。

美登素最初是从卫矛科、鼠李科、大戟科及苔藓等高等植物分离得到，但是其在植物中含量极低，提取的成本高、效率低，同时由于其复杂的结构，化学全合成也有成本高、收率低的缺点。因此，通过微生物发酵获得其前体安丝菌素再转化成美登素成为一种经济高效的方式。珍贵橙色束丝放线菌表达的安丝菌素中安丝菌素P-3的含量最高，由于其活性高、结构稳定、疏水性强已于萃取，成为合成美登素的最佳前体。因此通过放线菌发酵选择性地高表达安丝菌素P-3，对于其在抗肿瘤药物中的应用具有非常重要的意义。

现有技术报道的安丝菌素的制备工艺中，安丝菌素P-3最高产量是使用基因突变株Actinosynnema pretiosum PF4-4(ATCC PTA-3921)在900L发酵罐规模中304mg/L，20mL/250mL摇床中435mg/L(CN101103120A，WO03/064610A2)。其他现有技术US4162940、US4450234、US4228239、US4331598以及US4356265，安丝菌素的产量一般在12～100mg/L，安丝菌素P-3所占比例低于70％，并且其中混有不少不希望产生的安丝菌素成分，如N-脱甲基、20-O-脱甲基和19-脱氯处被修饰的产物，在还原性脱酰作用下这些产物不能合成美登醇。

目前，放线菌发酵安丝菌素的产量较低，生产成本高，安丝菌素P-3所占比例低，并且纯化工艺繁琐，涉及多种剧毒材料的处理，进行大规模生产非常困难。此外，在各个工艺步骤中还必须确保操作人员的安全。因此，筛选高表达安丝菌素的菌株或通过发酵工艺优化提高选择性地高表达安丝菌素P-3，对于安丝菌素的规模化生产和促进其在抗肿瘤药物中的应用具有非常重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种从珍贵橙色束丝放线菌发酵生产安丝菌素P-3的方法。

本发明的主要技术方案是选用高表达安丝菌素的珍贵橙色束丝放线菌，通过优化发酵培养基配方、发酵条件和补料工艺实现安丝菌素的高产量，并使其中安丝菌素P-3所占比例提高。

本发明的技术方案如下：

一种从珍贵橙色束丝放线菌制备安丝菌素P-3的方法，步骤如下：

(1)孢子培养：将在20％甘油管冷冻保存的束丝放线菌孢子在固体培养基培养皿划线培养，25～30℃培养3～9天，至生长出丰富孢子；

(2)种子培养：从培养皿刮取孢子，接种于液体种子培养基在25～30℃进行培养30～50h，获得种子液；

(3)发酵培养：取培养好的种子液接种于液体发酵培养基，于25～30℃发酵培养，溶氧控制20％以上，发酵持续时间350～450h；

步骤(1)中所述束丝放线菌优选的为珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)；

步骤(1)中所述固体培养基组分如下，均为重量百分比：

酵母提取物0.1～5％，大豆蛋白胨0.3～1.0％、麦芽浸膏0.1～0.5％，甘油0.5～1.5％，琼脂粉1.5～2.2％，自然pH；