[发明专利]使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法

权利要求书

1.一种使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法，其包括：

a)使用同源重组敲除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19基因；

b)筛选和鉴定正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞；以及

c)将所述正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞注射到卵母细胞胞质中，以产生半克隆的遗传修饰动物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤a)中使用CRISPR-Cas9方法辅助同源重组以高效敲除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19基因。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于在步骤a)中使用含有PGK-neo药物筛选元件的构建体，并在步骤b)中使用G418药物筛选敲除H19基因的单倍体胚胎干细胞。

4.根据前述权利要求所述的方法，其特征在于在步骤a)中将打靶构建体pCCI-H19、Cas9-sgRNA-4和Cas9-sgRNA-7质粒通过CRISPR-Cas9方法以电转染的方式导入单倍体胚胎干细胞中以敲除H19基因，优选地敲除H19基因及其上游DMR。

5.根据前述权利要求所述的方法，其中步骤b)筛选和鉴定正确敲除H19基因的单倍体胚胎干细胞的方法选自以下方法中的一个或多个或其组合：用于验证打靶正确性的Southernblot，用于确定基因组范围基因拷贝数变异的比较基因组杂交，潜在脱靶位点鉴定，检测干细胞标志物Oct4、Sox2、Nanog和SSEA1的表达，拟胚体形成实验，嵌合体小鼠实验，检测印迹基因H19、Igf2表达量。

6.根据前述权利要求所述的方法，其中进一步包括通过流式分选将正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞分选出，并在连续的传代中富集所述孤雄单倍体胚胎干细胞的步骤。

7.根据前述权利要求所述的方法，所述动物选自不包括人的哺乳动物，优选为啮齿类或灵长类哺乳动物，更有优选为小鼠、大鼠、食蟹猴，最优选为小鼠。

8.根据前述权利要求所述的方法，所述孤雄单倍体胚胎干细胞选自EG-1或OG-3小鼠单倍体胚胎干细胞，优选OG-3小鼠单倍体胚胎干细胞。

9.H19基因敲除的小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系在建立遗传修饰动物模型中的应用。

10.H19基因敲除的小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系在用于治疗雄性动物不育或遗传病的试剂盒中的应用。