[发明专利]使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及建立遗传修饰动物模型的方法，特别涉及使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法。

背景技术

哺乳动物胚胎干(ES)细胞具有自我更新(Self-renewal)的特性和多向分化的潜能(Pluripotency)，它既是再生医学研究和未来临床细胞治疗中的重要资源，也已经成为分子遗传学领域的重要研究工具，被广泛用于遗传修饰动物模型的构建。

传统的用于制作遗传修饰动物的方法是用基因打靶的方法对二倍体ES细胞进行遗传修饰，再将经过特定遗传修饰的ES细胞注射到发育的二倍体囊胚中以生成嵌合体动物及进入生殖系的基因修饰动物⁷¹。该方法已经在制作完全基因敲除或者条件性基因敲除小鼠方面得到了广泛应用。它通过在小鼠模型中有针对性地敲除某个或某几个基因以研究这些基因的在体功能，有助人们了解基因在胚胎发育及疾病发生发展过程中的作用，然而该方法必须首先在ES细胞中进行基因打靶，ES细胞的培养与遗传操作需要丰富的经验，这使得这一技术方法的应用具有很大的局限性。此外，某些动物还不能实现ES细胞的分离建系，也就无法使用基因打靶及囊胚注射的方法制作基因修饰动物。由于是二倍体ES细胞，该方法制作基因敲除小鼠时，需小鼠经过多次交配繁殖才能得到纯合突变小鼠，耗费大量的人力物力，且耗时较长，需要至少6个月的时间，这在一定程度上限制了该技术在基因功能研究中的应用。生殖系传递是决定能否获得目标小鼠的关键因素。生殖系传递的效率往往与ES细胞状态、细胞遗传背景、核型、小鼠状态及嵌合体小鼠嵌合率的高低相关。具有极大的不稳定性，在某些情况下甚至无法获得进入生殖系的目标小鼠。四倍体补偿(Tetraploidcomplementation)技术可以在一定程度上解决上述问题。四倍体胚胎是发育缺陷的，只能形成胚体外的胎盘组织，当将二倍体ES细胞或诱导多能干细胞(Inducedpluripotentstemcell,iPSC)注射到四倍体囊胚时可以发育成来自二倍体细胞的动物个体，它常用于证明二倍体多能干细胞的全能性⁷²。这就是四倍体补偿技术。小鼠ES细胞经遗传修时候再通过四倍体补偿技术即可获得经过人为修饰的目的小鼠。这种方法不需要经过嵌合体小鼠阶段，可以直接获得基因修饰小鼠，缩短了实验周期，节约了科研成本。同时该技术较易获得不同发育期的胚胎，在胚胎致死基因功能研究中有重要应用。然而，由于该技术用来制作基因修饰小鼠需要较多操作环节，如ES细胞的培养与基因修饰、四倍体胚胎的获得与体外培养、囊胚注射、小鼠交配等，目标小鼠的获得效率较低，国际上尚未普及此技术。

近年来研究人员成功实现了将小鼠的ES细胞或iPS细胞体外转化为生殖细胞，并最终培育出具有生殖能力的健康小鼠^73,74。2011年，KatsuhikoHayashi等使用特定的培养条件将培养的小鼠ES细胞或iPS细胞分化形成原始生殖细胞样细胞(PrimordialGermCell-LikeCells,PGCLCs)，并将其植入不能生育的小鼠睾丸中，产生了外观正常的精子。再通过胞浆内精子注射(IntracytoplasmicSpermInjection,ICSI)的方法将这些精子注射到雌性小鼠的卵细胞中，最终产下了可育的健康小鼠后代⁷³。2012年，同一研究小组成功地将雌性ES细胞或iPS细胞诱导成PGCLCs，并将这些细胞与雌鼠性腺细胞共培养，创造一个再造的卵巢。当将再造卵巢移植到小鼠卵巢囊时，PGCLCs成熟为生发泡期卵母细胞，成熟的卵母在细胞进行体外受精后可以生成健康可育的后代⁷⁴。使用胚胎干细胞制造出“人造精子”或“人造卵子”是生物医学领域的巨大突破，这也为男性不育或女性不孕症的治疗带来了希望。但这项技术要应用到人类还有很长的路要走，需要进行更多的研究和探讨伦理学的问题。此外，这项成果也为制作基因修饰动物提供了新思路。可以将经遗传修饰的ES细胞或iPS细胞诱导成PGCLCs，进而在体生成携带遗传修饰的精子或卵母细胞，进而通过体外受精的方法得到遗传修饰小鼠。该方法有很好的前景，但是操作难度较大，目前还难以广泛使用。