[发明专利]一种微泡复合的再生医用材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及再生医学及组织工程技术领域，特别涉及一种微泡复合的再生医用材料的制备方法。

背景技术

组织、器官缺损的修复和功能重建仍然是现代医学面临的难题。自体或异体组织、器官移植是目前最常用的治疗手段，然而存在着供体来源严重不足等缺陷。而组织工程概念的提出有望解决这一难题。组织工程学致力于研究在体外构建人体器官或组织的技术，利用生物可降解和相容性好的材料制备符合所需要器官或组织形态的3D支架，使吸附在材料上的干细胞按照特定方式逐渐生长为所需要的器官组织，如皮肤、软骨、血管、角膜、牙齿、骨头和膀胱等，具有极为广阔的临床应用前景。

近20年来，组织工程领域已取得极大的进展。其中，组织工程皮肤、软骨及膀胱等因其自身无血管或组织本身较薄，机体的氧气及养分能快速渗入移植物中维持种子细胞活性，已成功应用于临床。但对于一些较厚或更为复杂的组织或器官如肌腱、骨、心脏和肾脏等来说，由于移植物中心部位的种子细胞距离最近的毛细血管可达数百微米远，无法及时获得氧气和养分，从而过早凋亡，最终导致移植物中心部位坏死(necrotic core)。因此，如何促进移植物血管化是组织工程领域中亟需解决的一大难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微泡复合的再生医用材料的制备方法，以解决组织工程构建过程中，种子细胞因血管无法及时长入而过早凋亡的难题，为再生医学中生物材料血管化提供新的思路。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种微泡复合的再生医用材料的制备方法，包含下述步骤：(1)提取间充质干细胞来源微泡；(2)将步骤(1)中提取的微泡接种到组织工程骨支架材料上，经过孵育，得到微泡复合的再生医用材料。

与现有技术相比，本发明的实施方式首次提出了将微泡应用于组织工程骨构建的思路，公开了一种微泡复合的再生医用材料的制备方法，构建得到一种新型的促血管化生物材料。本发明的实施方式中所使用的微泡(microvesicles，MVs)，由细胞在静息或应激状态下产生释放，是一种被长期忽视的重要的细胞间通讯工具。由于其直接由母体细胞脱落产生，因而微泡携带有来自母体细胞的膜蛋白、胞质蛋白、脂类、DNA和RNA等，能反应母体细胞的特征，它与靶细胞通过直接融合、配受体相互作用或内吞等方式，将来自母体细胞的多种信息分子传递至靶细胞，从而介导细胞间的信息交流。本发明的实施方式中所选用的间充质干细胞来源微泡(MSC-MVs)，具有强大的促血管新生功能，能促进血管新生并及时为种子细胞提供氧气及养分，从而对植入体内处于低氧缺血环境下的种子细胞发挥保护效应。

本发明的实施方式将MSC-MVs接种于组织工程骨支架材料上，得到一种新的复合材料，实验证明该种复合材料能促进异位骨再生。此外，由于MSC-MVs在体内不易引起免疫排斥反应，具有良好的生物安全性，且能跨越物种发挥生物学效应，可能解决供者来源受限的问题。同时，MVs冻存方法简单(PBS重悬，负80℃冻存)并可长期保存，有望将MV包被的支架材料产品化，广泛应用于临床。此外，不仅是组织工程骨，其他更为复杂的组织工程器官如心脏和肾脏等的构建也可借鉴这种构建方法。

可选地，本发明的实施方式所提供的微泡复合的再生医用材料的制备方法，步骤(1)中的间充质干细胞可以来源于大鼠骨髓、大鼠脂肪、小鼠骨髓、小鼠脂肪、人骨髓、人脂肪或人脐带等。如上所述，间充质干细胞来源的微泡与组织工程骨支架材料复合之后，之所以具有强大的促进血管化的作用，是由于其内容物包含多种促血管新生因子、mRNA和miRNA，并且它能将其内容物传递至靶细胞从而介导细胞间信息交流，因而各种间充质干细胞来源的微泡均能用于本发明的实施方式中，与组织工程支架材料复合，实现促血管化作用，有效减少种子细胞因血管无法及时长入而过早凋亡的情况发生。

可选地，本发明的实施方式所提供的微泡复合的再生医用材料的制备方法，步骤(1)中，间充质干细胞来源微泡提取自培养至第3至4代的间充质干细胞，具体提取方法为：取第3至4代MSC用于提取MV，提取MV前，将MSC培养基更换为无血清培养基继续培养24h。收集细胞上清，2000×g离心20分钟，弃沉淀取上清，100000×g，4℃离心1小时，弃上清，PBS重悬沉淀，负80℃冻存备用。

可选地，本发明的实施方式所提供的微泡复合的再生医用材料的制备方法，步骤(2)中，组织工程骨支架材料为脱钙骨基质、聚己内酯、聚乳酸，聚α-羟基酸，聚醇酸，聚氧乙烯或聚乙二醇等。