[发明专利]船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法

权利要求书

1.一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)收集船舶不同压载舱压载水样品；

2)对船舶压载水样品进行预处理；

3)提取预处理后样品中微生物总DNA；

4)对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，得粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图，判断总DNA提取是否成功；

5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；所述专用引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

6)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，并判断总DNA片段在专用引物的引导下是否扩增成功；

7)将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，得变性梯度凝胶电泳分离电泳图，判断船舶压载水微生物种群多样性程度和压载水优势菌群的种类，分析船舶压载水微生物多样性；

步骤2)中所述预处理包括依次使用3μm和0.22μm微孔滤膜进行两级过滤抽取微生物、冷冻固定；

步骤3)中所述的提取是使用体积质量比为2％十六烷基三甲基溴化铵处理样品后，使用3S DNAIsolation提取试剂盒进行提取。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述不同压载舱为船舶不同空间位置的压载舱。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述PCR扩增所采用的PCR反应体系为：35μLddH₂O，5μL含15mmol/L镁离子的10*反应缓冲液，1μL如SEQ ID NO.1所示的上游引物，1μL如SEQ ID NO.2所示的下游引物，5μL脱氧核糖核酸，1μL Taq酶，2μL模板；PCR扩增程序为：起始95℃预变性5min，94℃变性1min，65℃退火1min，72℃引物延伸30s，20个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃引物延伸30s，15个循环；72℃终延伸8min，得到微生物PCR扩增产物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)中所述的变性梯度凝胶电泳包括：在基因突变检测系统上对PCR反应产物进行电泳分离，电泳结束后染色拍照。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)中还包括：使用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，得到变性梯度凝胶电泳条带强度图，根据每个条带的相对灰度计算细菌群落结构多样性指数H′和均匀度指数J，进而判断船舶压载水微生物种群多样性程度。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)中还包括：对获得的变性梯度凝胶电泳分离电泳图电泳谱带的特异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，可以得出压载水优势菌群的种类，从而确定微生物群落结构组成。