[发明专利]船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物分子生态学领域，具体涉及一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法。

背景技术

船舶压载水是船舶在空载时为了保持船体稳定性，在起航时压载进船舶压载舱的海水，抵达港口载货时则被排出压载舱。压载水及沉积物的排放是海洋生物在出发港和目的地港之间传播的主要途径，已被世界环保基金(GEF)认定为海洋面临的四大威胁之一。

船舶到港装货的同时将卸载压载水，同时对压载舱清理，由于压载舱的特殊结构，不能达到彻底清理，随船舶每次压载当地新鲜海水，带入压载舱的生物和非生物组成多样，压载水沉积物随着压载水的排入排出长期积累沉降。压载舱作为船舶存放压载水的特殊舱室，其结构复杂，压载舱内无光、缺氧、有的还可能含有有害物质，对生物的生存是极为不利的，大部分生物无法忍受压载舱中的恶劣环境而死亡，大量不能适应压载舱环境的生物死亡后，其尸体下沉落入舱底，给食腐生物提供了食物来源。由于船舶具有高的表面积与体积比，大面积的微生物附着在其表面，所以压载舱成了微生物的避难所，这种情况被称作“船体内部污垢”。目前通过船舶压载水和沉积物的排放，有害微生物可能在港口国之间传播，致病微生物可能会对环境内生物和人造成威胁，现阶段船舶压载水和沉积物中微生物生存状态并未完全探究，微生物的多样性还不明了。

目前国内压载水微生物多样性的研究主要是在港口调查停靠船舶压载水中细菌总数、大肠菌群等卫生指示菌和某些致病菌。利用分子生物学手段对船舶压载水中微生物进行研究还未完全展开，而微生物DNA提取作为分子生物学手段进行分析的第一步也是最重要的一步，其方法的研究还未见报道。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)最初被用于基因的突变检测，变性梯度凝胶电泳对不同DNA片段的分离原理是变性梯度凝胶电泳(DGGE)中同样长度但具有不同序列的DNA片段能够被分离。具有不同序列的DNA分子有不同的解链行为，将在凝胶的不同位置停止迁移。变性梯度凝胶电泳(DGGE)是建立在PCR反应对环境样品中的所有微生物的16SrRNA和18SrRNA等保守基因区间的DNA片断的扩增的基础上，这些被扩增出的DNA片断可以代表所有不同微生物的信息，这些使用同一引物对扩增出的不同微生物的DNA片断具有相同的碱基数，因此一般的电泳无法将它们分离开。由于变性梯度凝胶电泳(DGGE)可以将不同碱基顺序的相同大小的DNA片段予以分离，所运用PCR-DGGE技术可以对环境样品中的微生物多样性进行研究。

压载舱结构和压载水配给规律导致船舶压载水的物理、化学性质与河水、海水和环境污水存在高度差异，微生物数量和种群分布也明显不同，这就决定了不同环境下的样品在进行微生物群落构成分析时存在差异。目前国内外尚无关于运用PCR-DGGE技术进行船舶压载水微生物多样性研究的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法；本发明根据船舶压载水的特性，使用3μm和0.22μm微孔滤膜的两级过滤和冷冻固定，加固了微生物在滤膜上的附着，使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)处理，去除对DNA提取造成影响的物质，使得微生物总DNA的纯度达到直接进行后续分子生物学研究的需要，提取的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及变性梯度凝胶电泳，使用QuantityOne软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，判断船舶压载水微生物种群多样性程度，通过对特异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，可以得出压载水优势菌群的种类，从而确定微生物群落结构组成。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法，该方法包括以下步骤：

1)收集船舶不同压载舱压载水样品；

2)对船舶压载水样品进行预处理；

3)提取预处理后样品中微生物总DNA；

4)对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，得粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图，判断总DNA提取是否成功；

5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；所述专用引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

上游引物357F-GC(SEQ IDNO.1)：

5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，