[发明专利]一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法。

背景技术

随着水产养殖业迅猛发展，养殖水体富营养化日益加剧，导致蓝藻大量繁殖，蓝藻水华高频率爆发(曹煜成等，2007)。蓝藻会大量耗氧且能释放蓝藻毒素，败坏水质，造成水生动物中毒死亡，对水环境和养殖效益造成巨大影响(彭聪聪等，2011)。有研究表明，利用溶藻菌可特异性地抑制有害微藻，达到优化水体微藻群落的效果(王祥荣等，2010)。当前该领域的研究热点还主要为针对海洋赤潮和湖沼水华的有害微藻种类的特性与治理等方面，YANG等筛选了溶解赤潮中肋骨条藻(Skeletonemaostatum)的溶藻菌SK-5(YANGetal,2013)，THEERASAK等筛选了杀灭引起蓝藻水华的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)的放线菌(THEERASAKetal,2013)，但有关运用溶藻菌抑制池塘水体有害微藻的研究少见报道(TEEYAPORNetal,2012)。

池塘环境与开放性水体的环境差异巨大，在微藻优势种群结构、水体营养水平、人工技术措施等方面的差别致使针对开放性水域的相关研究无法直接借鉴到养殖生产应用中。对此，曹煜成等选用筛得的一株池塘蓝藻溶藻菌—蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)CZBC1(曹煜成等，ZL201310203745.3)，蜡样芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，广泛存在于环境中，目前已被应用于医药、农业生产等领域(李煜等，2012；李侠等，2001)。阳钢等通过向水体泼洒蜡样芽孢杆菌BC-1有效提高了刺参的生长速度(阳钢，2012)，何鉴尧等筛得两株蜡样芽孢杆菌L7和L8对螺旋鞘丝藻均有显著地控制效果(何鉴尧，2008)。曹煜成等筛得的蜡样芽孢杆菌CZBC1经实验室生态学试验证实，其具有适应广温、广盐、耐高pH和低耗氧的特性，可以通过直接或间接机制溶解浮游颤藻、绿色颤藻、小颤藻等有害蓝藻，具有良好的颤藻溶解专一性，对其他优良绿藻和硅藻等无溶解效应，并且对养殖对虾也无不良影响，适宜池塘水产养殖生产应用(曹煜成，2014)。

目前针对蜡样芽孢杆菌CZBC1菌剂的工业化液体—固体复合发酵生产方法还未见报道。虽然有学者就蜡样芽孢杆菌发酵工艺、溶藻菌发酵条件优化等进行过报道(王海云等，一株蜡样芽胞杆菌及其制备方法、应用，申请号201410223612.7；朱杰等，芽孢杆菌属溶藻菌的固体发酵与应用，申请号201210308126.6；孙梅等，一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用，申请号201310413693.2；荣小军等，一种蜡样芽孢杆菌及其制剂和应用，申请号201010602326.3；叶姜瑜等，响应曲面法优化溶藻细菌发酵条件的研究，2011；许珂等，溶藻细菌W5培养条件优化及发酵培养)，但其中研究的溶藻菌并非上述蜡样芽孢杆菌，并且蜡样芽孢杆菌也不是所有菌株都具有溶藻特性的，加之有不少有关溶藻菌发酵研究的报道多为研究性质，仍未达到菌剂的工业化发酵生产的需求，也未见相关菌剂的工业化生产产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，该方法确实了液体发酵和固体发酵的工艺参数，一方面保证该方法可满足蜡样芽孢杆菌制剂产品的工业化液体—固体发酵生产需求，另一方面保证形成的蜡样芽孢杆菌制剂产品并未因工业化和规模化的生产致使其溶藻特性和生长特性受到影响，仍具有良好的颤藻溶解专一性，对优良绿藻和硅藻无溶解效应，对养殖对虾也无不良影响，菌剂产品可用于养殖生产应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：一种溶解养殖池塘颤藻的蜡样芽孢杆菌制剂的工业化液体—固体复合发酵方法，包括以下步骤：

(1)确定蜡样芽孢杆菌CZBC1液体发酵的液体培养基和固体发酵的固体培养基；

(2)菌种活化培养：将保种的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行活化培养；

(3)扩大培养：将活化好的蜡样芽孢杆菌CZBC1菌种进行扩大培养，得种子液；

(4)液体发酵：将种子液接种到装有步骤(1)中确定的液体培养基中进行液体发酵培养至芽孢数量达到10¹⁰个/mL以上，得液体发酵后的种子液；

(5)固体发酵：将步骤(4)获得的液体发酵后的种子液接种至步骤(1)中确定的固体培养基中进行固体发酵培养至芽孢数量达到10⁹个/g以上，且芽孢获得率达到90％以上，得固体发酵物；