[发明专利]一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种靶向肿瘤的双调控重组腺相关病毒包装系统。

背景技术

恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一，目前临床治疗方法主要是采用放射治疗及化学疗法。然而，有些恶性肿瘤对放射治疗不敏感，对化疗易产生耐药性，而且这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的方法对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也取决于该特异性标记是否严格限制于肿瘤细胞内。

端粒是真核细胞保护染色体末端的结构，正常细胞每分裂一次，端粒就会缩短，当端粒缩短至一定程度时会导致细胞死亡。而当细胞发生恶变时，其端粒酶被激活，使肿瘤细胞分裂所致端粒的缩短进一步延长，从而维持染色体的稳定，使细胞逃逸死亡获得永生，最终导致肿瘤细胞不断增值，因此端粒酶激活在肿瘤细胞发生及发展过程中其关键作用。端粒酶在大约90％肿瘤细胞均阳性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，因此端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记。到目前为止，人的端粒酶由三个部分组成：1)RNA组分(hTERC)；2)端粒酶结合蛋白(TEP1)；3)端粒逆转录酶(hTERT)。最近研究表明端粒逆转录酶(hTERT)在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中端粒逆转录酶呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达。

正常细胞的能量主要来源于葡萄糖，氧供应充足的情况下正常的细胞组织主要通过糖酵解和线粒体呼吸两个步骤，将葡萄糖氧化成二氧化碳和水，为细胞生物活动提供能量，氧供应不足的时候依靠糖酵解供应能量。恶性肿瘤细胞即使在氧供应充足的条件下，仍然有高的糖酵解比例是恶性肿瘤能量代谢方面的一个特异性的表现，80年前OttoWarburg在肝癌细胞中首先发现这个现象，该现象被称为Warburg效应。己糖激酶是糖酵解和能量代谢的调节者，恶性肿瘤细胞中己糖激酶II(HKII)表达增高。HKII是目前研究最多的肿瘤细胞糖酵解酶。Ko等人通过动物实验显示，HKII药物抑制剂(3-BrPA)局部和全身用药可杀灭大部分肝移植瘤和肺转移瘤，但对癌周正常肝组织和其他主要脏器无损害作用，抑制HKII对化疗耐药的肿瘤细胞同样有明显的杀伤作用(KoYH，PedersenPL，GeschwindJF.GlucosecatabolismintherabbitVX2tumormodelforlivercancer：characterizationandtargetinghexokinase[J].CancerLett.2001，173(1)：83-91)。HKII在恶性肿瘤中的高度表达，是恶性肿瘤的生物学特征，也是肿瘤生存的需要。

近年来，由于病毒学、分子生物学及肿瘤学的飞速发展，人们已完成了多个病毒全部基因组的测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对病毒基因进行改造，改造后的病毒对肿瘤细胞的感染、复制增殖和溶解细胞的能力有效增强，而对正常细胞这种能力减弱甚至消失，因此这种病毒能在肿瘤细胞内进行选择性复制。目前研究最深入的溶瘤病毒包括I型单纯疱疹病毒-1(HSV-1)和腺病毒(ADV)等。腺相关病毒(AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒，AAV具有安全性好、宿主范围广、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转载体之一，但是其在溶瘤方面的应用研宄还未见有报道。

构建重组AAV需要有AAVITR序列(倒转末端重复序列)、Rep和Cap基因、宿主细胞和辅助病毒。目前在基因治疗研究中所用的AAV载体多数由2型AAV改造而来，AAV-2的ITR序列中包含了复制、包装、拯救及整合的信号；外源基因表达盒可完全取代AAV的编码序列，Rep和Cap基因产物则可由另一个质粒反式提供；AAV复制常用的辅助病毒为腺病毒，而腺病毒的辅助功能由E1a、E1b、E2a、E4和VARNA基因提供。

发明内容