[发明专利]丝状真菌基因组的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种丝状真菌基因组提取方法，尤其涉及一种产黄青霉菌基因组的提取方法。

背景技术

    工业微生物中，丝状真菌是一类十分重要的类群，尤其在抗生素、有机酸、酶制剂三大生产领域，丝状真菌的生产性能极为突出，如产黄青霉(Penicillium chrysogenum)是青霉素的重要生产丝状真菌；黑曲霉 （Aspergillus niger）是柠檬酸的重要工业发酵菌种; 里氏木霉(Trichoderma reesei ) 是纤维素酶的重要工业发酵菌种。为进一步提高青霉素、柠檬酸及纤维素酶的产量，从分子水平上对工业菌株进行改造有着广泛的应用前景。丝状真菌基因组DNA的提取是进行分子生物学研究的基础，但丝状真菌由于其细胞壁结构坚固，成分复杂，破壁困难，因此丝状真菌基因组提取方法与细菌相比要复杂得多。现行有效的丝状真菌基因组提取方法主要有：酶解法，研磨法、冻融法和微波法、CTAB法、SDS法、试剂盒法、尿素提取法等。这些方法都可以提出较高质量的基因组DNA，能够满足后续的如PCR反应的基因操作需求，但对于成千上万个丝状真菌转化子的分子鉴定及筛选，应用这些常规方法提取基因组，其繁杂的提取过程是限制实验进展的一个重要环节；另外，常规的提取方法中均采用多种试剂对细胞进行破壁处理、酚/氯仿抽提去除蛋白质、乙醇或异丙醇沉淀等多步骤提取DNA，提取过程冗长，且有机试剂具腐蚀性和毒性，对操作者身体健康不利。

发明内容

为解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种简易、安全，不需使用有毒试剂的丝状真菌基因组的提取方法。

为实现上述目的，本发明的一种丝状真菌基因组的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a、获取丝状真菌菌丝；

b、加入酶液：向丝状真菌菌丝加入蜗牛酶和纤维素酶的混合酶液，得到丝状真菌菌丝液；

c、超声处理：将步骤b获得的丝状真菌菌丝液于40~70W超声5~15min；

d、酶解：将步骤c处理后的丝状真菌菌丝液在25~40℃酶解10~15h，得到丝状真菌菌丝酶解液；

e、将丝状真菌菌丝酶解液静置，待丝状真菌菌丝酶解液分层后，获得供PCR鉴定用含有丝状真菌基因组的上清液；

在步骤a与步骤b之间或步骤d与步骤e之间，设有对丝状真菌菌丝或丝状真菌菌丝酶解液进行高温加热处理步骤，所述高温加热处理步骤中的加热温度为75~100℃，加热时间为5~15min。

对丝状真菌细胞仅进行酶解破壁处理，会因破壁后存在的大量杂质影响，造成DNA不稳定，使后续PCR过程扩增得不到基因条带。本发明采取酶解法, 结合超声处理与高温加热处理的方式：向丝状真菌菌丝加入蜗牛酶和纤维素酶的混合酶液，然后通过超声处理将丝状真菌菌丝分散到混合酶液中，破坏菌丝的致密状态，使大部分菌丝能够接触到混合酶液而被酶解，同时，超声作用有助于后续酶解反应的进行；之后通过高温处理对细胞裂解后释放的DNase等降解DNA的活性物质及混合酶液中存在的影响PCR反应的活性物质进行灭活，从而使丝状真菌菌丝酶解液的上清液可以直接进行PCR扩增得到丝状真菌18S rDNA基因条带。制备方法中高温加热处理也可在丝状真菌菌丝液加入混合酶液前进行，同样能够对细胞内存在的降解DNA及影响PCR反应的物质起到灭活的作用。本发明的提取方法操作流程简单，且不需使用试剂对DNA进行提纯，避免了毒性试剂对实验人员的伤害，简化了提取过程，使提取方法更安全，稳定。

作为对上述方式的限定，所述高温加热处理步骤中的加热温度为95~98℃，加热时间为10~15min。

作为对上述方式的限定，所述步骤e中丝状真菌菌丝酶解液静置前，用双蒸水稀释，混匀。

所获样品量大时通过稀释有利于PCR反应。

作为对上述方式的限定，所述步骤b每0.05~0.1mg丝状真菌菌丝加入混合酶液1mL，所述混合酶液中蜗牛酶浓度4~8mg/mL，纤维素酶浓度2000~6000U/mL。

酶浓度过低，不足以破坏细胞壁，致使DNA不能有效释放；酶浓度过高，细胞壁裂解完全，细胞膜受到破坏，致使DNA释放出来而被酶解液中物质降解，从而使PCR反应结果受到影响。

作为对上述方式的限定，所述混合酶液中蜗牛酶浓度6~8mg/mL，纤维素酶浓度2000~4000U/mL。