[发明专利]AS-PCR法检测抗嘧菌酯柑橘褐斑病菌的引物对和方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及检测抗嘧菌酯的柑橘褐斑病菌的引物对及检测方法。

背景技术

柑橘是国际上第一大水果，在我国也仅次于苹果的第二大水果，其经济重要性不言而喻。由交链格孢菌(Alternaria alternata)引起的柑橘链格孢褐斑病主要为害橘类，橘和柚或橘和橙的杂交柑橘，引起落叶、枯梢和落果，不脱落的果实也因果面的病斑难以上市销售，是感病柑橘生产中的严重障碍。

目前褐斑病的防治主要依赖化学药剂，嘧菌酯(通用名：azoxystrobin，商品名称：Abound、Amistar、Heritage、Quadris、Amistar Admire，中文通用名：安灭达、阿米西达)是先正达公司开发的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂或strobilurin类似物，是第一个登记注册的strobilurin类似物。嘧菌酯既能抑制菌丝生长又能抑制孢子萌发，并且对真菌分生孢子的产生也有显著的抑制作用，具有铲除、保护作用，并具有内吸及横向输导等特性，能有效防治子囊菌、卵菌、接合菌、担子菌和半知菌等真菌引起的病害，如：白粉病、锈病、颍枯病、网斑病、黑腥病、霜霉病、稻瘟病等，与目前市场上常用的杀菌剂相比，具有杀菌谱广、杀菌活性高，对非靶标生物和环境安全的特性。目前，嘧菌酯已在72个国家的84个作物上获得注册，应用于超过400个作物或病害系统中。对葡萄、柑橘、苹果、鳄梨及葫芦和扁桃等多种作物的采后病害防治都具有明显作用。研究证明该药剂对柑橘链格孢褐斑病具有良好的防治效果，并在美国佛罗里达州等地广泛推广。已有研究也表明，离体条件下嘧菌酯对中国柑橘链格孢褐斑病菌种群也具有优良的抑制效果，田间试验也证明这类药剂的防治效果。

嘧菌酯等甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的杀菌剂机制是：药剂与病菌线粒体细胞色素bc1酶复合体上的Qo(quinol oxidation)位点结合，阻止呼吸电子传递链的电子从细胞色素b(Cytb)到细胞色素c之间的传递，破坏菌体的呼吸作用而导致菌体死亡。尽管此类杀菌剂作用机制独特、性能优秀，但是该类杀菌剂作用位点单一，靶标位点自发突变频率较高，在高选择压力下，病原菌极易产生抗药性群体。

目前已发现的植物病原菌抗strobilurin类杀菌剂的抗性机理有以下几种情况：(1)多数情况下，植物病原菌是由于cytb基因143位的密码子由甘氨酸突变成了丙氨酸(G143A)而获得抗药性。此抗性的产生可能是由于甘氨酸突变为丙氨酸后，抑制剂与cytb之间的位阻增加，从而使植物病原菌获得抗药性。(2)是由于cytb基因129位的密码子由苯丙氨酸突变成亮氨酸(F129L)而获得了抗药性，该位点的突变可能造成抑制剂与靶标位点结合时需要的能量增加而使病原菌对杀菌剂产生了抗药性，但是该机制作用下的抗性没有G143A普遍，抗性水平也没有G143A的高，如：葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)。(3)此外，人们还发现了由于cytb基因上137位密码子由甘氨酸变成精氨酸(G137R)，使植物病原菌获得QoI类杀菌剂抗药性的情况，如：小麦黄斑叶枯病菌(Drechslera tritici-repentis)。

发明内容

本发明提供了一对引物，用于扩增抗嘧菌酯的柑橘褐斑病菌中Cytb基因143位氨基酸发生点突变的目的片段，检测柑橘褐斑病菌是否对嘧菌酯产生耐药。

引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在研究中发现柑橘褐斑病菌(交链格孢菌)对嘧菌酯的抗性分子机制是Cytb基因的单个碱基点突变，由G突变为C，导致143位氨基酸从甘氨酸变为丙氨酸。基于这一抗性分子机制，本发明设计了能特异性地从抗性菌株中扩增出条带的特异性引物对。

本发明提供了一种包含所述引物对的AS-PCR法检测试剂盒。该试剂盒除了包括上述特异性引物对，还包括dNTP、Taq聚合酶、PCR buffer、阳性对照DNA、阴性对照DNA。

所述的引物对在AS-PCR法检测抗嘧菌酯柑橘褐斑病菌中的应用。

本发明也提供了一种检测抗嘧菌酯柑橘褐斑病菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测菌的DNA；

(2)以提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物对进行AS-PCR扩增；

(3)AS-PCR扩增产物进行凝胶电泳分离，染色；