[发明专利]一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌转移诊断试剂盒

权利要求书

1.一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌诊断试剂盒，其特征在于：包括96孔板、捕获抗体、荧光标记的检测抗体、二抗、荧光防淬灭剂、CD45+磁珠及分选器、牛血清白蛋白组成；

所述的捕获抗体为兔抗人AFP和EpCAM捕获抗体；

所述的荧光标记的检测抗体为FITC标记的AFP捕获抗体检测抗体和Biotin标记的EpCAM捕获抗体检测抗体；

所述的二抗为抗-FITC-490及SA-550抗体；

具体操作步骤如下：

1)捕获抗体预包被

96孔板中加入1∶60稀释的AFP及EpCAM抗体100μL/孔，加盖37℃孵育1-2h或4℃过夜，弃包被液，用无菌的磷酸盐缓冲液洗板，每孔加200μL含牛血清白蛋白的PBS，加盖，37℃孵育1-2h，弃上清液，将板直接用于检测；

2)采集血液样本，并分离得到含循环肿瘤细胞的细胞群；

3)检测

包被的96孔板中，待检测孔加100μL细胞悬液，阴性对照孔加100μL 1640培养液，阳性对照孔加100μL含1×10⁴/mL的肝癌细胞株HepG2；

4)将96孔板放入湿润的培养箱在37℃、5％CO₂培养18-24h，弃上清液，用含0.1％Tween的PBS洗板；

5)每个孔中加入100μL用1％BSA的PBS稀释的荧光素标记AFP及EpCAM检测抗体，置37℃孵育1-2小时；

6)孵育后用PBS洗3次，3min/次，洗板后甩干，加入100μL用PBS 1∶1000倍稀释的抗-FITC-490及SA-550抗体(二抗)，置37℃孵育2小时；

7)每孔加入50μL荧光防淬灭剂，放置于室温闭光显色；

8)弃去荧光淬灭剂，将96孔板自然晾干；

9)计数每个反应空孔中红绿重合斑点的个数，判断结果。

2.根据权利要求1所述的一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌诊断试剂盒，其特征在于：判断方法为如果能检测到AFP和EpCAM双阳性的细胞即判定为阳性；如果检测不到AFP和EpCAM双阳性的细胞则判定为阴性。