[发明专利]一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌转移诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医学免疫学及肿瘤诊断技术领域，涉及一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌肿瘤细胞捕获及诊断试剂盒。

背景技术

原发性肝癌主要是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5位，发病率仍持续升高。目前已成为我国第二位癌症死亡原因。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步，但总体而言，肝癌的预后并没有得到显著的改善，5年生存率仅为5％左右。手术切除仍是最主要的治疗方法，转移复发己成为阻碍肝癌患者长期生存的关键。因此，临床上迫切需要探索肝癌转移复发的相关预测指标来优化治疗方案。对病人预后的准确评估可对高危转移复发病人增强辅助治疗或采用侵袭性较小的治疗方案，对低危转移复发病人避免过度治疗，从而使实现治疗个体化，提高病人的生活质量。

传统意义上的预后预测指标为肿瘤的临床病理分期和肿瘤细胞分化分级，该分期和分级能大致反映不同病人术后生存率的差别。但这些临床病理特征并不能准确预测转移复发和病人预后。恶性肿瘤都会通过血液传播转移到身体的其他器官，而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入到原发肿瘤细胞的周围组织中，进入血液和淋巴管系统，形成循环肿瘤细胞(CTC，circulating tumor cell)，并转运到远端组织，再渗出，适应新的微环境，最终“播种”、“增殖”、“定植”、形成转移灶。因此早期发现血液中的肝癌CTC，可提供更多信息，有望准确预测肝癌的转移复发，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。

外周血样本由于其获取技术简单、创伤小、便于在同一患者多次重复进行，易于被患者接受，对于预测转移复发的可能性更为重要。尤其是针对易于血道转移的肿瘤，利用外周血标本检测其中是否存在具有转移倾向的肿瘤细胞，临床意义更大。目前，已经开发的外周血中癌细胞特异性标记物，如AFP，MAGE、CK19基因，以及外周血游离DNA检测等已被初步用于转移复发的预测。然而，上述标志物既可能来源于原发灶肿瘤细胞，也可能来源于循环中的肿瘤细胞，因此，该标志物表达水平的高低并不能准确反映直接影响肿瘤转移的循环肿瘤细胞的情况。因此，寻找能够直接捕获到外周血循环肿瘤细胞的方法己成为近年来研究的热点。

目前现存的几种循环肿瘤细胞捕获技术主要包括：(1)基于流式荧光技术、免疫磁珠分离技术针对CTC细胞膜上特异性蛋白开发的Cell Search试剂盒；(2)利用肿瘤细胞体积较其他血细胞大的特性开发的ISET法(Isolation by size ofepithelial tumor cells)；(3)其他，如逆转录聚合酶联反应、免疫细胞化学法等。但是这些CTCs检测技术均存在其局限性与不足，从而局限了其应用。(1)Cell Search试剂盒的缺点是：操作复杂，费用高，计数效果低，能否从血液中检测到肿瘤细胞很大程度上依赖于可分析的细胞数量。(2)ISET法的缺点是：不适用于体积较小的细胞，体积小的CTCs有漏检可能，造成假阴性。同时也不适用于具有异质性的肿瘤细胞检测。(3)逆转录聚合酶联反应技术的缺点是：假阳性率较高，由于基因的非法转录和活性假基因，正常粒细胞可表达部分细胞角蛋白如CKZO、CK19；细胞形态学被破坏，无法进一步判断和进行肿瘤细胞基因和转录组变化；需要更严格的标本保存条件和实验条件。(4)免疫细胞化学法的缺点是：易造成靶细胞的丢失，检测灵敏性差。更重要的是，上述方法都是基于肿瘤细胞的表型特征，而不是基于其功能特征，因此不能保证检测到的循环肿瘤细胞的功能状态(无法辨别“活细胞”和“死细胞”)。考虑到有功能的循环肿瘤细胞才是造成肿瘤远处转移的罪魁祸首，因此，开发一种新的用于功能性的循环肿瘤细胞检测技术迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于为克服已有技术的不足，提供灵敏度高、特异性强的免疫学原理作为检测反应，组成ELISPOT肝癌诊断试剂盒，用于检测外周血中具有AFP及EpCAM分泌功能的循环肝癌细胞，提高肝癌检测的灵敏度和特异性，辅助肝癌转移的诊断和鉴别诊断。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种基于固相酶联免疫荧光斑点的肝癌诊断试剂盒，包括96孔滤膜板、捕获抗体、荧光标记的检测抗体、二抗、荧光防淬灭剂、CD45+磁珠及分选器、牛血清白蛋白(BSA)。

所述的捕获抗体为兔抗人AFP和EpCAM捕获抗体。

所述的荧光标记的检测抗体为FITC标记的AFP捕获抗体检测抗体和Biotin标记的EpCAM捕获抗体检测抗体。